论文题目: 耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物物理学
作者: 高冠军
导师: 华跃进
关键词: 耐辐射球菌,修复,启动子,结构域,蛋白质组
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans,简称DR)是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的生物之一,因对电离辐射、紫外线、干燥及一些DNA损伤试剂显示超强的抗性,一直倍受生物医学界和环境工程界的关注和重视。该细菌能够在几十个小时内准确无误地修复由辐射产生的几百个双链DNA碎片(Double-strand breaks, DSBs)而不发生任何突变,但目前这种DNA修复机制尚不清楚。现有研究表明,DR菌在极端环境(电离辐射、紫外线、干燥)下的生存是保护、耐受和修复三方面协同作用的结果,是独特的新陈代谢转换途径和高效精确的DNA修复系统有效地协调了DNA的损伤修复。因此,发现和研究新的与DNA修复及抗逆性相关的功能基因(或酶)并阐明它们的生物学功能对进一步探索DR菌的极端抗性与DNA修复机制具有重要的理论意义和应用价值。 作为同源重组修复途径的重要蛋白,DR菌RecA在DNA修复中起十分重要的作用。DR菌recA基因的突变株对电离辐射异常敏感。研究表明,DR菌缺乏多数原核生物中存在的由LexA介导的SOS修复途径,虽然基因组内两个LexA同源物都可被RecA催化进行自裂解反应,但都未参与recA基因的调控。据此推测,DR菌可能存在与其它原核生物迥然不同的DNA修复机制和途径。近来,我们筛选DR菌自然变异株时发现一株对电离辐射较为敏感的突变株,初步研究表明,该突变株的辐射敏感性是由基因组内编号为DR0167的基因(命名:pprI)内部插入了一个转座子而发生了突变。本研究主要围绕这一新发现的DNA损伤修复开关基因pprI,应用分子生物学的方法进一步鉴定该基因,研究该基因分子作用机制及相关的生物学问题,研究PprI结构域与功能的关系,并应用蛋白质组学的方法进一步探索PprI在辐射抗性方面的网络调控机制,研究结果如下: 1.为鉴定DR菌pprI基因与辐射抗性之间的关系,本研究首先构建了DR菌pprI基因内部反向插入抗生素抗性基因的突变株。研究发现,该突变株对电离辐射极为敏感,初步推测PprI是一个与DNA修复有关的辐射抗性因子。为进一步研究PprI生物学功能和作用机制,分别克隆pprI、recA和pprA基因,表达纯化了相应的蛋白质产物,
论文目录:
摘要
前言
第一章 耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI的发现
1.引言
2.材料与方法
2.1 菌株与试剂
2.2 菌株培养
2.3 pprI基因片段的克隆
2.4 pprI基因突变株制备
2.5 辐照处理后野生型与突变株的生存率
2.6 野生型与突变株中RecA和PprA表达差异检测
2.7 DR菌细胞提取液对自由基损伤DNA的保护作用
2.8 过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性分析
3.结果与分析
3.1 DNA修复缺陷株KH8401的辐射抗性鉴定
3.2 转座子IS8301插入鉴定
3.3 转座子IS8301插入位点的鉴定
3.4 pprI基因突变株构建及鉴定
3.5 RecA和PprA在野生型和突变株中表达差异
3.6 PprI对自由基损伤DNA的抑制效果检测
4.讨论
5.小结
6.参考文献
第二章 耐辐射球菌pprI基因基于生物信息学方法的分析
1.引言
2.材料与方法
2.1 材料
2.2 方法
3.结果与分析
3.1 pprI基因位置及序列、PprI氨基酸序列
3.2 同源性检索
3.3 结构域分析
3.4 局部高级结构预测
4.讨论
5.小结
6.参考文献
第三章 耐辐射球菌pprI、recA和pprA克隆、表达及抗体制备
第一节 pprI基因克隆、表达、蛋白质纯化及抗体制备
1.实验方法
1.1 pprI基因的克隆
1.2 pprI基因的表达
1.3 PprI重组蛋白的纯化
1.4 PprI抗体制备
1.5 PprI抗体纯化
2.结果与分析
2.1 pprI基因的克隆
2.2 pprI基因的表达与蛋白质纯化
2.3 PprI抗体制备及纯化
2.4 Western blot分析DR菌PprI的表达
3.讨论
第二节 recA基因克隆、表达、蛋白质纯化及抗体制备
1.实验方法
1.1 recA基因克隆
1.2 重组表达质粒和穿梭表达质粒的构建
1.3 RecA重组蛋白的表达和纯化
1.4 RecA多克隆抗体制备和Western blot分析
1.5 RecA补偿对E.coli(recA~-)细胞辐射抗性的影响
2.结果和分析
2.1 recA基因的克隆和表达质粒pET15brecA及pRADZ3recA的构建
2.2 RecA蛋白表达和纯化
2.3 E.coli(recA~-)中补偿DR菌RecA蛋白的免疫学分析
2.4 DR菌RecA的补偿对E.coli(recA~-)细胞辐射抗性的影响
3.讨论
第三节 pprA基因的克隆、表达、蛋白质纯化及抗体制备
1.实验方法
1.1 pprA基因的克隆和表达质粒的构建
1.2 PprA重组蛋白的表达
1.3 PprA融合蛋白质的纯化
1.4 PprA的抗血清制备
2.结果与分析
2.1 pprA基因的克隆
2.2 PprA融合蛋白的表达
2.3 PprA蛋白质的纯化
2.4 PprA多克隆抗体制备
3.讨论
第四章 耐辐射球菌pprI在E.coli中的表达对其抗逆性的影响
1.引言
2.材料和方法
2.1 材料和试剂
2.2 pprI基因的克隆和穿梭表达载体的构建
2.3 辐射条件下细菌的存活率
2.4 辐射条件下PprI的补偿对E.coli RecA表达的影响
2.5 化学发光法检测PprI的补偿对E.coli清除活性氧自由基能力的影响
2.6 H_2O_2氧化压力下的存活率
2.7 过氧化氢酶活性检测
3.结果与分析
3.1 pprI基因扩增和pRADZ3pprI构建
3.2 PprI的补偿对E.coli抗辐射的影响
3.3 PprI的补偿对E.coli RecA表达的影响
3.4 PprI的补偿对E.coli清除自由基能力的影响
3.5 PprI的补偿对E.coli H2O2压力存活率影响
3.6 PprI的补偿对E.coli过氧化氢酶活性的影响
4.讨论
5.小结
6.参考文献
第五章 耐辐射球菌pprI-folP基因簇启动子鉴定和基因表达
1.引言
2.材料与方法
2.1 菌种与质粒
2.2 培养与生长条件
2.3 质粒DNA及基因组DNA操作
2.4 folP突变株的制备
2.5 启动子-lacZ的融合构建
2.6 β-乳糖苷酶的分析
2.7 RNA的提取和引物延伸试验
2.8 射线处理后细胞生存率
2.9 启动子胁迫分析
2.10 Westren blot分析PprI表达水平
3.结果与分析
3.1 DR0167-DR0170基因簇排布
3.2 pprI和folP基因突变株构建及分析
3.3 pprI基因启动子图谱及转录起始位点的鉴定
3.4 补偿PprI的YA突变株生存率
3.5 folP可能不与pprI形成一个操纵子
3.6 辐照条件下启动子的活性分析
3.7 辐射条件下PprI的表达分析
4.讨论
5.小结
6.参考文献
第六章 耐辐射球菌PprI结构域与功能的解析
第一节 DR-E.coli穿梭质粒pRADK和pRADG的构建及应用
1.引言
2.材料与方法
2.1 菌株、质粒和培养条件
2.2 穿梭质粒的构建
2.3 质粒pRADK在DR菌突变株构建中的应用
2.4 重组质粒pRADG荧光鉴定及分析
2.5 质粒pRADG在DR菌中的应用
3.结果
3.1 质粒pRADK的构建
3.2 质粒pRADG的构建
3.3 重组质粒pRADG荧光鉴定
3.4 DR菌中RecA-eGFP融合蛋白表达和定位
3.5 recA基因启动子胁迫活性检测
3.6 基因功能补偿
4.讨论
5.小结
6.参考文献
第二节 耐辐射球菌pprI功能缺陷性和补偿性突变株体系的建立
1.引言
2.材料和方法
1.1 材料与试剂
1.2 pprI基因缺陷性突变株的建立
1.3 含不同pprI基因片段的功能补偿质粒的构建
1.4 辐照条件下各突变株的生长情况及生存率曲线
1.5 Western杂交检测目的蛋白的表达
3.结果与分析
3.1 DR菌pprI基因缺陷株基因组PCR鉴定
3.2 不同长度pprI基因片断功能补偿质粒酶切鉴定结果
3.3 Western杂交检测PprI蛋白在不同突变株中的表达
3.4 辐照后突变株的生长情况
3.5 辐照条件下突变株的生存率曲线
4.讨论
5.小结
6.参考文献
第三节 耐辐射球菌PprI结构域与辐射抗性的关系
1.引言
2.材料与方法
2.1 材料
2.2 pprI突变基因的产生及重组质粒的构建
2.3 变异PprI蛋白补偿后的辐射抗性
2.4 Western blot分析PprI PEST结构域与蛋白质稳定性的关系
2.5 Western blot分析PprI C-末端与蛋白质稳定性的关系
2.6 Western blot分析PprI C-末端对RecA表达的影响
3.结果与分析
3.1 各种突变pprI基因穿梭质粒的构建
3.2 补偿变异PprI蛋白后细胞的辐射抗性
3.3 辐射条件下补偿变异PprI蛋白后细胞生长情况
3.4 Western blot分析PprI PEST结构域对蛋白质稳定性的影响
3.5 Western blot分析PprI C-末端与蛋白质稳定性的关系
3.6 Western blot分析PprI C-末端对RecA表达的影响
4.讨论
5.小结
6.参考文献
第七章 蛋白质组学研究耐辐射球菌PprI网络调控机制
1.引言
2.材料与方法
2.1 细胞培养和辐射处理
2.2 细胞提取物的制备(样品制备)
2.3 双向电泳
2.4 电泳凝胶染色
2.5 图像分析和胶内酶解制备样品
2.6 肽质量指纹谱测定
2.7 数据库检索
3.结果与分析
3.1 野生型菌株R1与pprI突变株YR1(未辐照处理)蛋白表达谱差异
3.2 野生型菌株R1电离辐射前后蛋白表达谱差异
3.3 pprI突变株YR1电离辐照前后蛋白表达谱差异
3.4 辐照条件下R1与YR1蛋白表达谱差异
4.讨论
5.小结
6.参考文献
总论
博士期间发表论文(含待发表)
致谢
发布时间: 2005-07-22
参考文献
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