微囊藻毒素-LR对草鱼和斑马鱼免疫基因表达及草鱼免疫器官超微结构的影响

论文摘要

微囊藻毒素可影响鱼类的胚胎发育、行为和生长,也可引起肝脏、肾脏等内部器官的病理变化和鱼体生理生化指标的变化。然而,有关微囊藻毒素对鱼类免疫系统毒性的研究则几乎是空白。本研究以草鱼和斑马鱼为对象,采用电镜、荧光定量PCR和基因芯片技术在细胞和分子水平上揭示了MC-LR对鱼类免疫系统的影响。通过腹腔注射微囊藻毒素-LR（MC-LR;纯度＞98%,50μg/kg体重）,发现MC-LR不仅引起草鱼肝脏病变,而且还引起免疫器官的病变。MC-LR对肝细胞的早期毒性表现为细胞间连接间隙增宽,肝细胞中出现胆汁淤积,其线粒体和内质网也受到损伤,但到注射MC-LR 21天后草鱼肝细胞超微结构基本正常。在脾脏和头肾中受损的细胞主要是淋巴细胞。MC-LR可引起草鱼脾脏淋巴细胞的凋亡,在注射MC-LR 2天后,观察到大量细胞出现凋亡;7天后,凋亡细胞减少,到21天大部分细胞与对照组没有差异;MC-LR可引起草鱼头肾淋巴细胞线粒体、内质网损伤,到21天则观察不到这样的病理变化。用荧光定量PCR检测了草鱼在注射MC-LR（纯度＞98%,50μg/kg体重）1、2、4、7、14和21天后,白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Ⅰ型干扰素（IFNⅠ）、免疫球蛋白M（IgM）、主要组织相容性复合体Ⅰ（MHC-Ⅰ）、长链肽聚糖识别蛋白（PGRP-L）等六个免疫基因在脾脏、头肾和肝脏中的表达。发现IL-1β在头肾中的表达受到抑制,在所有的取样时间内与对照组均有显著差异（P＜0.05）。肝脏、脾脏和头肾中TNF-α、IFNⅠ和PGRP-L的表达同样受到了显著抑制（P＜0.05）;肝脏中IgM和MHC-Ⅰ的表达则受到显著抑制（P＜0.05）。这说明MC-LR可抑制草鱼的免疫功能。经腹腔注射MC-LR（纯度＞95%,400μg/kg体重）12、48、96小时后,取斑马鱼肝脏,利用三个时间段的混合样品和对照组分别与Affymetrix公司斑马鱼基因芯片进行杂交,筛选差异表达的基因。该基因芯片包括14900个转录本,处理组斑马鱼的基因表达与对照组的比值大于等于2或小于等于0.5时,认为该基因表达上调或下调。经两次芯片重复实验发现有273个基因（10.13%）出现了表达水平的变化,表达上调的基因数为243个,下调的仅为30个。根据基因的功能注释进行分类,上调的基因主要包括细胞骨架结构类、细胞外基质成分、凋亡基因、肿瘤因子、应激因子、信号转导因子、细胞循环因子、生长因子、运输因子、转录因子、代谢相关基因和免疫因子;下调的基因主要包括免疫相关的基因。进行基因本体论（Gene Ontology）分析发现MC-LR主要引起细胞循环（Cell cycle）和丝裂原活化蛋白激酶信号通路（MAPK signal pathway）的变化,通路分析结果表明MC-LR可能引起了斑马鱼肿瘤的发生,而大量免疫基因表达的下调则表明MC-LR可能抑制了斑马鱼的免疫功能,这也与在草鱼中观察到的结果一致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第一章 微囊藻毒素及其对鱼类的毒理学影响:综述
• 1 微囊藻毒素的产生、分布及其毒性机理
• 1.1 水体富营养化的形成及影响
• 1.2 微囊藻毒素的产生
• 1.3 微囊藻毒素的化学结构和理化性质
• 1.4 微囊藻毒素在天然水体中的含量及分布
• 1.5 微囊藻毒素的检测方法
• 1.6 微囊藻毒素的毒性机理
• 2 微囊藻毒素对鱼类的毒理学影响
• 2.1 微囊藻毒素在组织中的积累
• 2.2 微囊藻毒素对胚胎孵化的影响
• 2.3 微囊藻毒素对鱼类行为和生长的影响
• 2.4 微囊藻毒素对鱼类心律的影响
• 2.5 微囊藻毒素对血清生化指标的影响
• 2.6 微囊藻毒素对氧化酶和解毒酶活性的影响
• 2.7 微囊藻毒素引起的鱼类组织病理
• 2.8 微囊藻毒素的遗传毒性
• 2.9 微囊藻毒素的免疫毒性
• 3 本研究的目的
• 第二章 微囊藻毒素-LR对草鱼脾脏、头肾和肝脏超微结构的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.2 实验鱼的处理
• 2.3 电镜样品的制备
• 2.4 DNA凝胶电泳
• 3 结果
• 3.1 脾脏
• 3.2 头肾
• 3.3 肝脏
• 3.3.1 细胞连接的变化
• 3.3.2 胆汁淤积
• 3.3.3 微囊藻毒素-LR对肝脏线粒体的影响
• 3.3.4 微囊藻毒素-LR对肝脏内质网的影响
• 3.3.5 微囊藻毒素-LR对肝脏其他的影响
• 3.4 DNA片段化
• 4 讨论
• 第三章 微囊藻毒素-LR对草鱼免疫相关基因表达的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验鱼的处理
• 2.2 RNA的提取
• 2.3 RNA样品中DNA的去除
• 2.4 cDNA模板的准备
• 2.5 标准曲线的建立
• 2.5.1 引物设计
• 2.5.2 PCR扩增及目的片段的纯化
• 2.5.3 连接和转化
• 2.5.4 测序
• 2.5.5 质粒的制备
• 2.5.6 质粒的稀释
• 2.6 荧光定量PCR
• 2.7 统计分析方法
• 3 结果
• 3.1 RNA质量的检测
• 3.2 反转录效果的检测
• 3.3 基因的非特异性检测
• 3.4 标准曲线的绘制
• 3.5 微囊藻毒素-LR对草鱼六个免疫相关基因表达的影响
• 3.5.1 微囊藻毒素-LR对白介素-1β表达的影响
• 3.5.2 微囊藻毒素-LR对肿瘤坏死因子-α表达的影响
• 3.5.3 微囊藻毒素-LR对Ⅰ型干扰素表达的影响
• 3.5.4 微囊藻毒素-LR对长链肽聚糖识别蛋白表达的影响
• 3.5.5 微囊藻毒素-LR对免疫球蛋白M表达的影响
• 3.5.6 微囊藻毒素-LR对主要组织相容性复合体Ⅰ表达的影响
• 4 讨论
• 4.1 白介素-1β
• 4.2 肿瘤坏死因子-α
• 4.3 Ⅰ型干扰素
• 4.4 长链肽聚糖识别蛋白
• 4.5 免疫球蛋白M
• 4.6 主要组织相容性复合体Ⅰ
• 第四章 利用基因芯片技术对微囊藻毒素-LR处理斑马鱼后肝脏基因表达谱的研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 斑马鱼的处理
• 2.2 RNA的提取
• 2.3 样品RNA的荧光标记
• 2.3.1 第一链cDNA的合成
• 2.3.2 第二链cDNA的合成
• 2.3.3 双链cDNA的纯化
• 2.3.4 生物素标记cRNA的体外合成
• 2.3.5 cRNA的纯化
• 2.3.6 cRNA的定量
• 2.3.7 cRNA的片段化
• 2.4 斑马鱼靶标杂交
• 2.5 斑马鱼阵列的清洗、染色和扫描
• 2.5.1 探针阵列的清洗与染色
• 2.5.2 芯片扫描
• 2.6 数据分析
• 2.7 Pathway分析
• 2.8 荧光定量PCR验证实验
• 3 结果
• 3.1 RNA质量检测结果
• 3.2 差异表达基因分析
• 3.4 Pathway分析结果
• 3.5 荧光定量PCR的验证结果
• 4 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢