牛奶主要致敏原组分的分离纯化和分析

论文摘要

[目的]牛奶过敏症的诊断治疗以及低/无过敏原配方奶研制的关键是牛奶过敏原组分的分离、纯化及标准化。本研究分离纯化出牛奶中引起过敏反应的致敏原组分,通过分析与组胺释放的关系研究其免疫活性进而鉴定出牛奶主要过敏原组分,为研制适用于中国人的过敏原标准化疫苗提供依据。[方法]采用等电点沉淀、（NH4）2SO4盐析法、Sephadex G-50凝胶层析和DEAE-Sepharose离子交换层析等方法分离、纯化牛奶过敏原组分。分别以脱脂乳、乳清、酪蛋白和β-Lg免疫C57/BL6小鼠。免疫印迹分析牛奶致敏原组分。间接ELISA检测免疫小鼠血清中sIgE和sIgG;同时改良荧光法检测牛奶不同致敏原组分体外诱发96孔板内不同免疫原腹腔致敏C57/BL6小鼠MC组胺释放率。[结果]分离、纯化出酪蛋白、β-Lg、α-La等牛奶过敏原组分,纯度＞90%。免疫印迹表明酪蛋白是牛奶主要致敏原组分。间接ELISA检测免疫C57/BL6小鼠血清中sIgE与sIgG;结果表明抗血清sIgG水平显著升高,sIgE水平低;组胺释放率与sIgG水平是一致的,而与sIgE水平没有相关性。脱脂乳中最主要的过敏原组分为酪蛋白,乳清中最主要的过敏原组分为β-Lg。组胺释放实验结果表明酪蛋白和β-Lg之间有重要的相似表位。[结论]组胺荧光检测法和sIgG水平可用于牛奶过敏原组分的鉴定和评价,为食物过敏原标准化提供研究方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1.1 食物过敏原
• 1.2 食物过敏症的发病机制
• 1.2.1 IgE介导的食物过敏症
• 1.2.2 T细胞介导的食物过敏症
• 1.2.3 IgE相关/T细胞介导的食物过敏症
• 1.3 食物过敏症防治
• 1.3.1 特异性治疗
• 1.3.2 非特异性治疗
• 1.4 食物过敏原的检测方法
• 1.5 牛奶中过敏原组分
• 1.6 本研究的意义和内容
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 鲜奶
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要试剂配制方法
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 乳清蛋白的制备
• 2.2.2 等电点法分离纯化酪蛋白
• 4）₂SO₄分段盐析'>2.2.3 乳清（NH₄）₂SO₄分段盐析
• 2.2.4 Sephadex G-50凝胶层析
• 2.2.5 DEAE-Sepharose离子交换层析
• 2.2.6 过敏原蛋白定量
• 2.2.7 过敏原蛋白的SDS-PAGE分析
• 2.2.8 免疫C57/BL6小鼠
• 2.2.9 Western-Blotting分析脱脂乳致敏原组分
• 2.2.10 间接ELISA检测过敏原特异性抗体
• 2.2.11 PMC的收集和纯化
• 2.2.12 致敏PMC脱颗粒的镜下观察
• 2.2.13 荧光法测定腹腔致敏PMC组胺定向释放
• 2.2.14 统计学分析
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 脱脂乳中致敏组分的分离、纯化
• 3.1.1 牛奶中总蛋白含量测定
• 3.1.2 牛奶中过敏原组分的SDS-PAGE分析
• 4）₂SO₄两步法盐析乳清蛋白'>3.1.3 （NH₄）₂SO₄两步法盐析乳清蛋白
• 3.1.4 Sephadex G-50凝胶层析结果
• 3.1.5 DEAE-Sepharose离子交换层析结果
• 3.2 免疫C57/BL6小鼠
• 3.3 Western-blotting分析脱脂乳致敏原组分
• 3.4 免疫血清sIgE和sIgG的检测
• 3.4.1 最佳包被抗原量
• 3.4.2 间接ELISA检测免疫血清中sIgG
• 3.5 体外诱发腹腔致敏C57/BL6小鼠PMC组胺定向释放率的测定
• 3.5.1 组胺测定标准曲线
• 3.5.2 脱脂乳致敏C57/BL6小鼠PMC组胺定向释放
• 3.5.3 乳清致敏C57/BL6小鼠PMC组胺定向释放
• 3.5.4 酪蛋白致敏C57/BL6小鼠PMC组胺定向释放
• 3.5.5 β-Lg致敏C57/BL6小鼠PMC组胺定向释放
• 3.5.6 配方乳体外诱发不同组分致敏C57/BL6小鼠PMC组胺定向释放
• 第四部分 讨论
• 4.1 牛奶致敏原组分的分离、纯化
• 4.2 免疫C57/BL6小鼠
• 4.3 荧光法检测不同致敏原组分体外诱发主动致敏PMC组胺定向释放率
• 参考文献
• 综述
• 致谢