小桐子甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）基因的克隆与功能研究

论文摘要

小桐子（Jatropha curcas L.，Euphorbiaceae）原产于热带美洲，目前遍布于亚洲和非洲的热带和亚热地区，具有易繁殖、抗旱、生长迅速、可适应广泛的农业气候条件和含油量高等特点，是具有巨大开发潜力的木本油料树种之一。但小桐子种子含油量不稳定且产量相对较低，限制了小桐子在生物柴油产业化开发中的利用。要提高小桐子种子含油量就必须了解其种子发育过程中油脂积累的分子机制。甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）是叶绿体中植物磷脂酰甘油生物合成过程中的第一个酰基酯化酶，它将脂肪酰转移到3-磷酸甘油的C-1位上合成1-酰基-sn-甘油-3-磷酸（溶血磷脂酸）。近年来研究发现甘油-3-磷酸酰基转移酶是植物生物合成储存油脂过程中的限速酶，对油料作物种子含油量具有重要的限制作用。因此，通过基因工程的手段对GPAT进行改造可能是改善TAG脂肪酸成分并提高植物油含量的有效途径。本研究以小桐子实验材料，克隆得到了两个小桐子甘油-3-磷酸酰基转移酶的基因，分别命名为JcGPAT1和JcGPAT2。通过序列相似性分析发现两个基因与其他植物中的GPAT有很高的相似性。分析基因在小桐子不同组织及种子发育的不同阶段的表达模式，研究基因在小桐子中的转录水平表达情况，鉴定JcGPAT1和JcGPAT2基因对小桐子油脂合成的调控作用。通过构建基因的酵母表达载体转化酿酒酵母的野生型和突变体菌株，在酵母表达系统鉴定了该基因编码的酶的功能。为研究其在模式植物拟南芥中功能我们还构建了种子特异性表达载体。主要结果如下：根据NCBI已知的小桐子质体GPAT（ACR61638）的序列，设计特异性引物，从小桐子种子中克隆获得JcGPAT1。其cDNA全长为1389bp，编码462个氨基酸，有与其他植物GPAT基因，如蓖麻和红花，有较高的相似性（从63％至79％）。实时定量PCR结果表明，JcGPAT1在发育中的种子的表达量，与在叶片中的表达量相比，处于低水平表达。以不同植物中甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的保守区域序列为基础，设计简并引物，结合RACE技术，从小桐子种子中克隆获得JcGPAT2（HQ395225）的cDNA全长序列。其cDNA核苷酸序列长度为1672bp，开放阅读框为1125bp，编码375个氨基酸。该基因具有明显的GPAT结构域，其编码的氨基酸序列与油桐、蓖麻等植物具有很高的相似性。半定量表达分析表明，该基因在小桐子发育的种子、叶、根尖等多个组织表达。在酿酒酵母的野生型和突变体菌株中对JcGPAT1和JcGPAT2进行了异源表达。运用分光光度法测定转基因酵母的生长曲线，通过香草醛法测定稳定生长期的转基因酵母的油脂含量。结果表明，转入JcGPAT2和转入对照质粒的对酵母的生长趋势和油脂含量没有明显的影响，说明JcGPAT2对酵母油脂的累积没有起到积极的作用；而转入JcGPAT1的酵母菌株比转空载体对照菌株生长慢，但是积累的油脂增多。因此它可能参与甘油磷脂的生物合成。本研究不仅提供了关于两个小桐子GPAT的序列信息，还对其表达和调控模式进行了研究。了解这些信息对于理解油脂合成的分子机制，以及鉴定种子发育过程中油脂积累的限速酶具有很重要的指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 开发可再生资源的必要性及其来源
• 2 世界生物柴油的发展现状
• 2.1 世界生物柴油发展态势
• 2.2 生物柴油的研究及应用现状
• 2.3 生物柴油的发展前景
• 3 木本油料植物小桐子
• 3.1 生态习性及分布
• 3.2 小桐子制取生物柴油的特点及优势
• 3.3 小桐子生物柴油产业化的发展及瓶颈问题
• 4 植物油脂生物合成及甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）
• 4.1 植物油脂生物合成
• 4.2 关于 GPAT 的研究进展
• 5 研究的目的及意义
• 6 主要研究内容及技术路线
• 6.1 主要研究内容
• 6.2 技术路线
• 第二章 小桐子甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）的克隆与序列分析
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂和酶
• 1.3 引物合成与测序
• 2 实验方法
• 2.1 实验相关溶液的配制
• 2.2 小桐子基因组DNA的提取
• 2.3 总RNA提取及质量检测
• 2.4 反转录合成cDNA
• 2.5 JcGPAT1的克隆
• 2.6 JcGPAT2的克隆
• 2.7 小桐子 GPAT 的序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 小桐子JcGPAT1全长cDNA序列的克隆
• 3.2 小桐子JcGPAT2全长cDNA序列的克隆
• 3.3 JcGPAT1的序列分析
• 3.4 JcGPAT2的序列分析
• 4 小结与讨论
• 第三章 小桐子甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）的表达模式研究
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂和酶
• 1.3 引物合成与测序
• 2 实验方法
• 2.1 实验相关溶液的配制
• 2.2 荧光定量PCR分析JcGPAT1的表达模式
• 2.3 半定量RT-PCR分析JcGPAT2的表达模式
• 3 结果与分析
• 3.1 小桐子JcGPAT1的表达模式分析
• 3.2 小桐子JcGPAT2的表达分析
• 4 小结与讨论
• 第四章 酵母表达载体的构建及在酿酒酵母中的表达
• 1 实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 试剂和酶
• 1.3 引物合成与测序
• 2 实验方法
• 2.1 实验相关溶液的配制
• 2.2 酵母表达载体的构建及酿酒酵母遗传转化
• 2.3 转基因酿酒酵母转录水平的检测
• 2.4 转基因酿酒酵母生长曲线测定
• 2.5 转基因酿酒酵母油脂百分含量测定
• 3 结果与分析
• 3.1 JcGPAT1、JcGPAT2的扩增
• 3.2 JcGPAT1、JcGPAT2酿酒酵母表达载体构建
• 3.3 JcGPAT1、JcGPAT2在酿酒酵母中的表达分析
• 3.4 转基因酿酒酵母菌株生长曲线和油脂百分含量的测定
• 4 小结与讨论
• 第五章 植物表达载体的构建
• 1 实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 引物合成与测序
• 2 实验方法
• 2.1 种子特异性表达载体pCAMBIA-Napin-Nos的构建
• 2.2 构建的 JcGPAT1、JcGPAT2 种子特异性表达载体
• 2.3 重组植物表达载体对农杆菌菌株的转化
• 3 结果与分析
• 3.1 种子特异性表达载体的构建
• 3.2 JcGPAT1/JcGPAT2种子特异性表达载体的构建
• 3.3 根癌农杆菌的转化及检测
• 4 小结与讨论
• 第六章 总结与展望
• 1 主要工作总结
• 2 工作展望
• 参考文献
• 课题资助及论文发表情况
• 致谢