β-内酰胺酶快速检测试剂盒的研究

论文摘要

β-内酰胺酶俗称生鲜牛乳抗生素分解剂，又名解抗剂或金玉兰酶制剂，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶是违法添加的非食用物质，它的使用掩盖了牛奶中抗生素的残留。β-内酰胺酶分解青霉素钾的分解产物是青霉噻唑酸，青霉噻唑酸具有还原性和酸性，运用碘量法、酸度法、高效液相色谱法、分光光度法等方法测定样品中青霉噻唑酸的含量，间接检测牛奶中的β-内酰胺酶。1.利用SDS-PAGE电泳法对β-内酰胺酶标准品和市场上的生鲜牛乳抗生素分解剂进行对比研究，确定生鲜牛乳抗生素分解液的成分为β-内酰胺酶。使用碘量法分别检测β-内酰胺酶标准品和生鲜牛乳抗生素分解剂的酶活度。测定结果表明β-内酰胺酶标准品的酶活度为24.552万U/mL，生鲜牛乳抗生素分解剂的酶活度为23.808万U/mL。利用液质联用色谱仪对青霉素钾酶解产物进行分析,质谱图中青霉素钾的特征峰m/z373不明显，未出现m/z333和m/z289峰，青霉噻唑酸特征峰m/z307.0出峰明显，表明青霉素钾在β-内酰胺酶作用下基本完全酶解，酶解后的主要产物是青霉素噻唑酸。用pH为12～14的氢氧化钠溶液把青霉素钾完全水解成青霉噻唑酸，利用高效液相色谱法测定青霉素钾及青霉噻唑酸的出峰时间，并研究青霉噻唑酸和β-内酰胺酶浓度的相关性。随着β-内酰胺酶添加量的增加，青霉素噻唑酸的峰值逐渐增大，R2为0.9331，线性关系良好，青霉噻唑酸的含量与β-内酰胺酶的含量呈正相关。2.青霉噻唑酸可与碘离子反应显蓝色，利用直接碘量法对β-内酰胺酶进行定性测定，间接碘量法对β-内酰胺酶定量测定，R2为0.9895，相关性良好，最低检出限为15U/mL；青霉噻唑酸具有酸性，利用β-内酰胺酶对青霉素钾进行酶解，对反应温度、底物浓度、反应时间等反应条件进行优化，利用pH计测量牛奶pH值变化，建立pH值与β-内酰胺酶相关性曲线，R2为0.9917，相关性良好，实际最低检出限为12.3U/mL。3.青霉噻唑酸具有还原性，可以将二价铜还原为一价铜，而亚铜试剂2,2’-联喹啉与一价铜离子偶联生成紫红色络合物，利用可见分光光度计测定络合物，在547nm处有最大吸收峰，且颜色随着β-内酰胺酶浓度的增大而加深。利用可见分光光度计扫描反应产物紫红色络合物，可知络合物在547nm处有最大吸收峰，且其颜色深浅与β-内酰胺酶浓度大小成正相关。最优反应条件为显色时间为15min，底物浓度50U/mL，0.05%2,2’-联喹啉添加量为2.4mL，20mmol/LCuSO4添加量为0.2mL，样液添加量为0.1mL。在最佳优化条件下建立β-内酰胺酶检测梯度，建立线性关系，R2为0.9936，相关性良好，理论最低检出限为3.44U/mL，实际最低检出限为4U/mL。做抗干扰性试验，可知具有还原性的抗坏血酸试剂不影响试验显色效果。4.在可见分光光度法试验基础上，设计β-内酰胺酶快速检测试剂盒，试剂盒由试剂、比色管和标准比色卡三部分组成。选择0～200U/mL范围内的8个样品，在最优条件反应条件下制作β-内酰胺酶标准比色卡。试剂包括A液为13%的TCA，B液为0.05%2,2’-联喹啉乙醇溶液，C液为20mmol/L的0.1mlCuSO4，检测样品时选择最优条件，即2,2’-联喹啉添加量为2.4mL，20mmol/LCuSO4添加量为0.2mL，样液添加量为0.1mL，置入比色管中，混合均匀，显色反应15min后，将试剂颜色与β-内酰胺酶标准比色卡比照，确定样品中β-内酰胺酶浓度。将试剂盒检测法与碘量法、酸度法、高效液相色谱法及可见分光光度法对比，可知，试剂盒法具有检出限低、操作简便、经济实用等优点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 课题的背景及意义
• 1.2 国内外研究现状与发展趋势
• 1.2.1 牛奶中抗生素和β-内酰胺酶残留的现状
• 1.2.2 牛奶中抗生素及β-内酰胺酶残留的来源
• 1.2.3 抗生素残留的危害及β-内酰胺酶残留危害
• 1.2.4 β-内酰胺酶检测的研究现状
• 1.3 课题研究意义及内容
• 1.3.1 课题研究意义
• 1.3.2 课题研究内容
• 第二章 β-内酰胺酶及β-内酰胺类抗生素酶解产物分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验设备
• 2.2.3 试验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 液质联用色谱法分析青霉素酶解产物
• 2.3.2 高效液相色谱法分析青霉素酶解产物
• 2.3.3 β-内酰胺酶对青霉噻唑酸生成量的影响
• 2.3.4 SDS-PAGE 电泳
• 2.3.5 酶活度检测结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 碘量法、酸度法检测牛奶中的β-内酰胺酶
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验设备
• 3.2.3 试验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 碘量法
• 3.3.2 酸度法
• 3.4 本章小结
• 第四章 分光光度法检测牛奶中的β-内酰胺酶
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 试验设备
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 试验原理
• 4.3.2 可行性试验
• 4.3.3 确定影响因素
• 4.3.4 条件优化
• 4.3.5 检测梯度、标准曲线及最低检出限的确定
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 可行性试验
• 4.4.2 确定影响因素
• 4.4.3 条件优化
• 4.4.4 检测梯度、标准曲线及最低检出限的研究
• 4.5 本章小结
• 第五章 牛奶中的β-内酰胺酶快速检测试剂盒的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.2 试验仪器
• 5.2.3 试验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 比色卡的制备
• 5.3.2 β-内酰胺酶快速检测试剂盒的制备
• 5.3.3 5种检测方法的对比
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历