纳米二氧化硅包裹绿色荧光蛋白作为生物荧光探针的研究

论文摘要

荧光探针已经被广泛应用在生物医学领域,包括呈像、传感、诊断。荧光性质当然是其作为荧光探针的首要条件,但是荧光探针的生物安全性是他们可以在生物医学领域应用的关键。荧光染料是第一代的荧光探针,并且沿用至今,但是由于有机染料在稳定性和安全性方面存在的严重问题,其在生物医学领域的应用已经逐步被新型的纳米探针取代,例如量子点。量子点具有较高的荧光性质,如狭窄的发射光谱,荧光强,高抗光漂白,因此得到了广泛的研究。然而多数量子点材料(如CdSe等)含有重金属元素,其重金属的毒性是一个潜在隐患,使其应用受到局限;虽然由硅胶或聚合物封装可减少重金属离子释放的风险,但仍然存在安全隐患。同样,纳米颗粒包裹荧光染料作为荧光探针,也因染料的毒性和泄露性这一重大缺点,限制了其作为荧光探针在生物体内的应用。绿色荧光蛋白(GFP)最早是从水母中提取的一种荧光蛋白质,目前已经发展成为一系列发射不同波长并具有优异荧光性能的的荧光蛋白质。他们高的量子产率和荧光稳定性使得他们还可以作为单个分子的检测。但目前荧光蛋白的应用主要是基于基因水平操作的,纯化的蛋白质由于蛋白质自身的不稳定性(酶解、变性等)尚无法作为单独的荧光探针使用。本论文的主要围绕制备一种新的生物安全性好、荧光性能优异的荧光探针展开研究工作。主要的研究思路是利用纳米二氧化硅包裹绿色荧光蛋白来提高蛋白的稳定性和生物安全性。我们采用了两种不同的方法利用纳米二氧化硅包裹绿色荧光蛋白:1)非共价连接包裹法纳米二氧化硅由于较好的生物相容性在包裹蛋白方面已经被广泛的研究,例如作为生物传感器、生物反应器、显像以及载药等。不幸的是最近的一项研究表明纳米二氧化硅非共价包裹蛋白的包裹率严重依赖于被包裹蛋白的等电点(pI)。带负电的蛋白(pI <7)由于静电排斥很难被同样带负电荷的纳米二氧化硅颗粒包裹且极易泄漏。为了解决这个问题我们在EGFP (pI =5.99)的C端加上了组氨酸标签,并在广泛使用的反相微乳液体系中加入微量的钙离子,通过钙离子与EGFP上的组氨酸标签之间的络合作用成功地将EGFP包裹在纳米二氧化硅内,并且也成功地包裹了其他带负电的蛋白。我们发现纳米二氧化硅包裹以后的EGFP在稳定性和荧光性能方面都有很大的提高,显示它在生物显像方面潜在的应用前景。2)共价连接包裹法由于非共价连接的方法无法避免被包裹蛋白的泄漏,所以不利于体内长时间现象方面的应用。所以我们又发展了一种通过共价连接的方式将EGFP包裹在纳米二氧化硅颗粒内的方法。我们首先将EGFP上的羧基与APTS一端的氨基进行共价连接,然后APTS与EGFP共价连接的产物在反相微乳液体系中水解将EGFP以共价连接的方式包裹在的纳米二氧化硅内。和非共价连接法相比,共价连接法制备得到的纳米二氧化硅包裹的EGFP具有更好的荧光性能以及稳定性,使得它可以作为稳定、安全的生物荧光探针使用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 荧光探针
• 1.1.1 有机荧光染料
• 1.1.2 量子点纳米颗粒（QDs）
• 1.1.3 荧光蛋白
• 1.2 复合型纳米荧光探针
• 1.2.1 脂质体
• 1.2.2 高分子荧光纳米颗粒
• 1.2.3 核壳型荧光二氧化硅纳米颗粒
• 1.3 核壳型荧光二氧化硅纳米颗粒的研究进展
• 1.3.1 复合荧光二氧化硅纳米颗粒的特点
• 1.3.2 核壳型荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法
• 1.3.3 核壳型荧光二氧化硅纳米颗粒在生物医学领域中的应用
• 1.4 课题的立题思想及研究内容
• 第二章 非价连接法制备包裹GFP 的纳米二氧化硅探针
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 反相微乳液法制备二氧化硅纳米颗粒
• 2.2.2 非共价连接法制备包裹绿色荧光蛋白纳米二氧化硅颗粒
• 2.2.3 研究思路
• 2.3 实验结果表征和分析
• 2.3.1 电子显微镜表征
• 2.3.2 绿色荧光蛋白包裹率测定
• 2.3.3 “络合法”原理验证—有无组氨酸标签影响验证
• 2.3.4 “络合法”原理验证—有无钙离子影响验证
• 2.3.5 “络合法”原理验证—其它组氨酸标签的蛋白和多肽包裹验证
• 2.3.6 荧光表征
• 2.3.7 纳米探针进入细胞的荧光表征
• 2.3.8 荧光探针稳定性表征
• 2.3.9 XRD 表征
• 2.3.10 本章实验试剂、仪器一览
• 2.4 本章小结
• 第三章 共价连接法制备包裹EGFP 的纳米二氧化硅颗粒
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验原理
• 3.2.2 实验步骤
• 3.3 实验结果表征和分析
• 3.3.1 电子显微镜表征
• 3.3.2 绿色荧光蛋白包裹率测定
• 3.3.3 绿色荧光蛋白泄露情况的测定
• 3.3.4 荧光增强现象
• 3.3.5 纳米探针进入细胞的荧光图象
• 3.3.6 荧光探针稳定性表征
• 3.3.7 主要实验试剂、仪器
• 3.4 本章小结
• 第四章 总结与展望
• 4.1 研究总结
• 4.2 研究展望
• 参考文献
• 作者攻读硕士学位期间科研成果及获得奖项
• 致谢