禽流感四通道丝网印刷碳电极酶免疫传感器的研制

论文摘要

禽流感（avian influenza,AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）引起的一种传染性疾病,其传播对象不仅是禽类,还有人、猪、马、海洋哺乳动物等。近几年来,不少国家和地区相继爆发了H5N1高致病性禽流感疫情,给世界范围内的家禽业以及相关联的产业造成巨大的经济损失,同时也严重威胁到人类健康。研究AIV及其抗体的快速检测技术是早期确定疫情及免疫效果评定的最有效手段之一,显得尤为重要。免疫传感器作为一种新兴的生物传感器以其鉴定物质的高度特异性、敏感性和快速等优点,显示出广阔的应用前景。电化学免疫传感器是将免疫技术与电化学检测相结合的一种新型免疫传感器,因其选择性好,分析速度快,灵敏度高,不受样品颜色、浊度的影响（即样品可以不经处理,直接进行检测）,所需仪器设备相对简单,在免疫传感器研究中起着越来越重要的地位,受到食品工业、环境检测和临床医学等领域的重视。本论文主要围绕以下几个方面开展了一些工作:1.四通道丝网印刷碳电极的制备及性能检验本试验采用丝网印刷工艺制备了几种一次性多通道电极,工作电极为碳电极,参比电极为银/氯化银电极,对电极为碳电极。经试验选定四通道丝网印刷碳电极为支持电极,用于后续工作的研究。采用形态学表征和电化学表征评估电极的一致性。试验用物理吸附法将辣根过氧化物酶（HRP）固定于四通道丝网印刷碳电极上,制得用于检测过氧化氢（H2O2）的酶电极。采用循环伏安法进行电化学表征,以硫堇作为氧化还原反应探针,H2O2的测定线性范围是2.5×10-5mol/L～7.0×10-4mol/L,检测限为1.5×10-5mol/L（S/N=3）。该传感器具有制备简单快速、经济、响应快、灵敏度高的性能,且具有良好的稳定性、重现性和准确性。2.禽流感病毒H5N1抗原一次性电流型酶免疫传感器的研制本试验将HRP-anti-AIV H5N1掺杂于壳聚糖中,并修饰于丝网印刷碳电极表面,从而制备一次性禽流感病毒H5N1抗原（AIV-Ag H5N1）电化学免疫传感器。试验中采用直接法检测AIV-Ag H5N1,免疫传感器在待测样品中20℃孵育10 min。抗原-抗体免疫反应生成的免疫复合物部分屏蔽了免疫电极表面HRP的活性中心,从而减弱了HRP对硫堇和过氧化氢的催化能力。采用循环伏安法监测酶促反应,利用还原电流的减小来测定样品中的AIV-Ag H5N1。在优化的免疫反应条件及电化学检测条件下,免疫电极线性检测范围为3.75～125 ng/mL,检出限为0.56 ng/mL（S/N=3）。该免疫电极具有较好的特异性、重现性（RSD＜7.1%）、稳定性（两周后电流响应为初始值的91.46%）和准确性（与AGP符合率为91.2%）。另外,将四通道丝网印刷碳电极用于禽流感免疫传感器的制备,结果表明免疫电极的一致性有较好的改进。因此,该免疫传感器有望用于AIV-Ag H5N1的快速检测。3.禽流感病毒H5N1抗体一次性四通道电流型酶免疫传感器的研制本试验将AIV-Ag H5N1掺杂与壳聚糖金胶膜中,并修饰于四通道丝网印刷碳电极表面,研制了快速检测禽流感病毒H5N1抗体的四通道丝网印刷碳电极电化学免疫传感器。试验中采用循环伏安法和激光共聚焦显微镜表征免疫电极。采用间接法检测禽流感病毒H5N1抗体和循环伏安法监测辣根过氧化物酶对硫堇与过氧化氢的催化反应,利用还原电流的变化率来测定血清中的禽流感病毒H5N1抗体。在优化的免疫反应条件及电化学检测条件下,设定判定标准如下:K＜20%为阴性;20%＜K＜30%为可疑样品;K≥30%为阳性。该免疫传感技术具有较好的特异性、重现性（RSD=2.48%）、稳定性（11 d后响应电流为初始电流的89%）和准确性（与AGP符合率为92.9%）。该免疫传感器有望用于禽类的宰前检疫,为禽流感的有效防控提供保障。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 食品安全现状
• 1.2 禽流感病毒的危害及检测现状
• 1.2.1 禽流感及其危害
• 1.2.2 禽流感病理症状
• 1.2.3 禽流感的流行现状
• 1.2.4 禽流感诊断检验现状
• 1.3 快速检测禽流感的必要性及重要性
• 1.4 免疫分析
• 1.4.1 抗原
• 1.4.2 抗体
• 1.4.3 抗原-抗体反应
• 1.4.4 免疫分析的类型
• 1.5 电化学免疫传感器概述
• 1.5.1 电化学免疫传感器的原理
• 1.5.2 电化学免疫传感的分类
• 1.5.3 抗原/抗体固定化方法
• 1.5.4 电化学免疫传感器检测方法
• 1.5.5 电化学免疫传感器的研究进展和发展趋势
• 1.6 电化学免疫传感器在食品安全检测中的研究
• 1.6.1 用于微生物检测的研究
• 1.6.2 用于毒素检测的研究
• 1.6.3 用于农药、兽药残留检测的研究
• 1.6.4 用于环境污染物、重金属检测的研究
• 1.7 本论文的研究意义、目的与创新
• 1.7.1 本论文的研究意义
• 1.7.2 本论文的研究目的
• 1.7.3 本论文的创新点
• 第2章 四通道丝网印刷碳电极的制备及性能检验
• 2.1 试验部分
• 2.1.1 仪器与试剂
• 2.1.2 丝网印刷碳电极的设计与研制
• 2.1.3 电极预处理
• 2.1.4 酶电极的制备
• 2.1.5 电极性能的检测方法
• 2.1.6 数据处理与绘图
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 多通道丝网印刷碳电极的选择
• 2.2.2 4-SPCE形态学表征
• 2.2.3 4-SPCE的电流响应
• 2.2.4 4-SPCE一致性分析
• 2.2.5 酶电极的循环伏安表征
• 2.2.6 酶电极扫速与峰电流的关系
• 2.2.7 条件优化
• 2.2.8 酶电极的线性响应
• 2.2.9 重现性、稳定性及准确性
• 2.3 小结
• 第3章 禽流感病毒H5N1抗原一次性电流型酶免疫传感器的研制
• 3.1 试验部分
• 3.1.1 仪器与试剂
• 3.1.2 相关试剂的配制
• 3.1.3 免疫电极的制备
• 3.1.4 免疫反应
• 3.1.5 检测方法
• 3.1.6 数据处理与绘图
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 SPCE的筛选
• 3.2.2 免疫电极的循环伏安表征
• 3.2.3 免疫电极扫速与峰电流的关系
• 3.2.4 免疫检测条件的优化
• 3.2.5 线性响应
• 3.2.6 特异性
• 3.2.7 准确性
• 3.2.8 重现性和稳定性
• 3.2.9 4-SPCE对免疫电极一致性的改进
• 3.3 小结
• 第4章 禽流感病毒H5N1抗体一次性四通道电流型酶免疫传感器的研制
• 4.1 试验部分
• 4.1.1 仪器与试剂
• 4.1.2 相关试剂的配制
• 4.1.3 免疫电极的制备
• 4.1.4 免疫反应
• 4.1.5 检测方法
• 4.1.6 数据处理与绘图
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 免疫电极的循环伏安表征
• 4.2.2 免疫电极扫速与峰电流的关系
• 4.2.3 形态学表征
• 4.2.4 免疫检测条件的优化
• 4.2.5 免疫电极的选择性
• 4.2.6 准确性
• 4.2.7 重现性和稳定性
• 4.3 小结
• 第5章 总结与展望
• 参考文献
• 附录 英文缩略表
• 研究生期间发表与待发表论文
• 研究生期间申报的专利
• 致谢