含狂犬病病毒SRV9株G基因的重组犬2型腺病毒的构建

论文摘要

狂犬病（rabies）是由狂犬病毒（rabies virus）感染引起的一种自然疫源性人兽共患传染病。该病全世界广泛分布,一旦发生无法医治,且由于传染源广泛存在,控制和消灭该病难度很大。目前,进行疫苗接种是预防和控制狂犬病的有效途径。采用基因工程技术进行基因重组活疫苗的研究,是当前狂犬病免疫研究的热点。以病毒为载体的重组活载体疫苗能够很好地表达外源基因,其表达产物能诱导机体产生高水平的细胞免疫和体液免疫。 犬二型腺病毒是较为理想的病毒载体,其E3区为复制非必需区,E3区缺失或E3区插入外源DNA病毒仍能复制,因此E3区是构建复制型犬二型腺病毒载体的理想位点。插入E3区外源DNA大小与E3区缺失大小是能否获得重组病毒的关键因素。 在前期成功克隆犬2型腺病毒（CAV-2）感染性全基因组的基础上,对犬2型腺病毒（CAV-2）感染性全基因组进行了改造,用EcoRI、Xbal、AscI和XbaI对CAV2全基因组质粒pPoly Ⅱ-CAV-2进行酶切改造得到了改造后的pPoly Ⅱ-CAV-2-new质粒。然后以E3重组质粒pVAX-E3为基础,通过DraⅢ和ssp Ⅰ双酶切,缺失犬2型腺病毒全基因组重组中25097bp～26141bp之间共1044bp的E3片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因、SV40polyA构成的总长2424bp的表达盒,获得了重组质粒pVAX-E3-CGS。然后用NmI和Sall对重组质粒pVAX-E3-CGS和腺病毒载体pPoly Ⅱ-CAV2-new（34.7kb）进行双酶切,将CGS克隆到pPoly Ⅱ-CAV2-new载体上。再用AscⅠ和ClaⅠ双酶切pPoly Ⅱ-CAV2-CGS-new（34.7kb）,游离重组基因组CAV2-CGS（32.7kb）。CAV2-CGS基因在脂质体LipofectamineTM2000介导下转染MDCK细胞系,8d后重组病毒在MDCK细胞系上实现了病毒包装。 Western印迹试验标明,重组病毒CAV2-CGS能够表达狂犬病毒糖蛋白。同时在连续传代40代后每隔5代提取重组病毒全基因组进行酶切鉴定,发现其酶切位点保持不变。在对昆明鼠和本动物进行免疫后,重组病毒能够诱导昆明鼠和本动物产生抗狂犬病毒SRV9株特异性中和抗体。而且,本动物试验发现免疫途径不同产生的抗狂犬病毒SRV9株的特异性中和抗体滴度不同,经口服、点眼、滴鼻等途径免疫的动物产生的抗狂犬病病毒SRV9株特异性中和抗体滴度明显高于肌肉注射免疫所产生的抗体滴度,这为其用于狂犬病的预防奠定了基础。

论文目录

• 第一章 狂犬病病毒与犬二型腺病毒研究进展
• 1 狂犬病病毒研究进展
• 1.1 狂犬病病毒
• 1.2 狂犬病预防与防制
• 1.3 狂犬病疫苗
• 2 犬腺病毒研究进展
• 2.1 犬腺病毒结构与特征
• 2.2 犬腺病毒基因组结构及其功能
• 2.3 犬腺病毒的复制
• 2.4 犬腺病毒载体的构建
• 2.5 犬腺病毒载体的应用概况
• 3 狂犬病病毒重组活疫苗的研究进展
• 第二章 含狂犬病病毒SRV9株G基因的犬二型腺病毒株的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒
• 1.1.2 毒株
• 1.1.3 菌株
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 主要仪器
• 1.1.6 实验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 感受态细胞的制备
• 1.2.2 质粒的制备与DNA操作
• 1.2.3 ELISA
• 1.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳
• 1.2.5 Western blotting
• 1.2.6 MDCK细胞的操作
• 1.2.7 重组犬二型腺病毒的转染
• 1.2.8 重组犬二型腺病毒基因组的提取
• 1.2.9 血凝试HA
• 1.2.10 TCID50测定
• 1.2.11 重组犬二型腺病毒的构建与包装
• 1.2.11.1 狂犬病病毒SRV9株糖蛋白表达盒CGS的构建
• 1.2.11.2 CGS与转移载体pVAX1-E3的连接
• 1.2.11.3 载体pIIL的改造
• 1.2.11.4 犬二型腺病毒全基因组质粒pCAV2的改造
• 1.2.11.5 pPoly Ⅱ—CAV2-CGS的构建
• 1.2.12 重组犬二型腺病毒株动物试验
• 1.2.12.1 重组犬二型腺病毒株小鼠试验
• 1.2.12.2 重组犬二型腺病毒犬试验
• 2 结果和分析
• 2.1 pVAX1-E3酶切鉴定
• 1-E3-CGS的构建'>2.2 pVAX₁-E3-CGS的构建
• 2.3 pPolyⅡ-CAV2-CGS的构建
• 2.4 重组犬二型腺病毒的转染
• 2.5 重组犬二型腺病毒CAV2-CGS基因组酶切鉴定
• 2.6 Western Blotting结果
• 2.7 重组犬二型腺病毒遗传稳定性试验结果
• 2.8 重组犬二型腺病毒动物试验结果
• 2.9 重组犬二型腺病毒血凝试验
• 50的测定结果'>2.10 重组犬二型腺病毒TCID₅₀的测定结果
• 3 讨论
• 3.1 关于犬二型腺病毒载体
• 3.2 目的基因选择
• 3.3 靶细胞的选择
• 3.4 重组病毒的转染
• 3.5 重组毒的遗传稳定性
• 3.6 重组病毒的免疫反应
• 3.7 重组病毒的免疫途径
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢