逼尿肌细胞、ICCs细胞自发性钙瞬变发生及调控机制的研究

论文摘要

背景及目的:膀胱逼尿肌是一种特殊的平滑肌组织,逼尿肌组织在受到神经支配的同时,是否存在类似心脏和胃肠道平滑肌的自发性兴奋,曾经是个认识不清的问题。我科对之进行了较系统的研究后发现:①离体条件下膀胱逼尿肌肌条可出现自发的兴奋性收缩;②离体膀胱逼尿肌条在多种神经递质拮抗剂“鸡尾酒”式的混合阻断下,仍然能产生收缩。以上研究结果及国外相关研究让我们认识到:逼尿肌组织具有自主产生兴奋的能力,这种自发性肌源性兴奋并不依赖于神经因素的作用而存在。我们的实验研究还发现,在膀胱流出道梗阻和神经源性异常引起的逼尿肌不稳定（Detrusor instability,DI）时,这种肌源性的自发兴奋和收缩明显增强,表现为:不稳定逼尿肌肌条与正常逼尿肌肌条相比,自发性收缩的幅度和频率明显增加;同等张力负荷下不稳定逼尿肌肌条的自发性收缩频率较正常逼尿肌肌条明显增加。膀胱逼尿肌兴奋性增高亦常见于临床,如继发于神经源性膀胱功能障碍及膀胱出口梗阻时。这一异常现象的发生目前被归咎为两个基本的机制:①神经源性学说。这一学说居主导地位,以de Groat为代表,强调所有兴奋性改变均源于神经因素,或为神经因素的延续效应,主要是表现在神经受体的数量和功能的上调。②肌源性学说。以Brading为代表,认为兴奋性改变除神经因素作用外,尚有肌源性异常因素参与,包括逼尿肌肌细胞的兴奋性增高、细胞间信号传导功能的加强、逼尿肌细胞与神经节细胞的联系增加,以及膀胱内可能存在的起搏细胞功能数量及功能的上调等。对膀胱肌源性兴奋的机制进行研究将有望为相关膀胱功能障碍性疾病开创新的治疗策略提供理论基础。在膀胱兴奋的肌源性学说这一理论中,膀胱内是否存在具有起搏功能的细胞至关重要,也一直为人们所重视。Cajal间质细胞（Interstitial cells of cajal,ICC）是一类与平滑肌细胞在形态及功能上均不相同细胞,业已证明这些细胞是胃肠道、输尿管等器官的起搏细胞,这些器官的平滑肌自发性兴奋均起源于其中ICCs细胞。McCloskey等及Shafik等采用c-kit特异性标记的方法,先后证实了在豚鼠和人的膀胱中存在ICCs细胞,这种细胞呈长梭形,在去极化时不能产生自发收缩,有别于正常的逼尿肌肌细胞,更为特异的是这种细胞c-kit表达呈阳性,它们主要沿肌束分布,并可产生钙活动,与神经和平滑肌细胞也有广泛的联系,极可能是起搏细胞或是兴奋调节细胞。后续ICCs细胞功能方面的研究发现,ICCs细胞具有自动除极的外向电流,c-kit的特异性阻断剂Glivec可显著抑制逼尿平滑肌束的自发性动作电位和兴奋收缩能力;提示ICCs细胞可能具备自动除极化,完成自动起搏的能力,这从功能学上肯定了ICCs细胞的存在以及其作为起搏细胞的可能性。但ICCs细胞是否是膀胱逼尿肌自发性兴奋的起搏细胞,目前尚无明确结论;开展膀胱逼尿肌组织中相关研究,特别对ICCs细胞和平滑肌细胞的自发性兴奋特征进行对比,将为阐明膀胱ICCs细胞是否是膀胱起搏细胞及其可能具有的功能提供重要的研究证据。钙离子是细胞内信号转导重要的第二信使,在平滑肌细胞中,钙自发性释放入胞浆导致的钙火花(Ca2+spark)及细胞外钙内流诱导内质网中钙释放(Ca2+ induced Ca2+ release, CICR)均是通过Ⅱ型Ryanodine受体（RyR2）完成的。细胞钙瞬变(Ca2+ transients)与动作电位的发生关系密切,是动作电位发生的重要信号。动作电位相关的平滑肌细胞膜去极化可致细胞膜上电压门控的钙离子通道开放,细胞外钙内流随后通过CICR作用诱导细胞内质网（sarcoplasmic reticulum,SR）中的钙释放入胞浆,导致细胞浆内钙离子浓度瞬间升高,引起细胞发生钙瞬变和平滑肌收缩。环腺苷二磷酸核糖（Cyclic adenosine diphosphate ribose,cADPR）是细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的代谢产物,是目前为止除钙离子外,平滑肌细胞内对细胞内质网上RyR2有调节作用的又一重要第二信使。以往的研究发现,cADPR可通过调控平滑肌细胞内质网RyR2开放对平滑肌细胞钙瞬变的发生及钙瞬变特征产生显著调节作用,其具体机制为:cADPR可通过影响细胞自发性瞬时外向电流（spontaneous transient outward currents,STOCs）、自发性瞬时内向电流（spontaneous transient outward currents,STICs）影响平滑肌细胞去极化,并可通过影响钙诱导的钙释放（CICR）影响平滑肌细胞细胞钙瞬变的幅度。但目前cADPR调节平滑肌细胞内质网钙释放的作用机制仍不清楚,研究结论还存在较大的矛盾。探讨cADPR调节平滑肌细胞内质网中钙释放这一cADPR调控细胞钙瞬变发生关键环节的机制,将为深入了解cADPR调控平滑肌细胞钙瞬变的过程提供实验依据。考虑到细胞钙瞬变与细胞动作电位的发生密切相关,cADPR可通过影响细胞内质网中钙释放进而调控平滑肌钙瞬变的发生及其特征,本研究拟以细胞钙瞬变为观察指标,比较分析ICCs细胞和平滑肌细胞自发性钙瞬变的特征及发生机制;并以反映平滑肌细胞内钙释放的STOCs和钙火花(Ca2+ spark)为观察指标,通过利用FKBP12.6基因敲除小鼠,对cADPR调节平滑肌细胞内质网中钙释放的机制进行探讨。本研究将有助于我们深入对平滑肌细胞和ICCs细胞自发性钙瞬变特征、发生和调控的认识,并为阐明膀胱ICCs细胞的功能提供初步的研究证据。本研究拟从以下四个方面展开:第一:利用免疫荧光单染及双染的方法,观察ICCs细胞在逼尿肌组织中的分布及与平滑肌细胞的关系,为后续平滑肌细胞和ICCs细胞自发性钙瞬变的检测提供参考;第二:对膀胱逼尿肌组织铺片中的平滑肌细胞和相邻ICCs细胞自发性钙瞬变进行检测,比较分析两种细胞自发性钙瞬变的频率和幅度,初步探讨平滑肌相邻ICCs细胞可能的功能;第三:检测细胞外钙内流及细胞钙库中钙释放干预因素对细胞自发性钙瞬变的影响,探讨细胞外钙内流及细胞内质网中钙释放入胞浆在两种细胞自发性钙瞬变发生的作用;第四:对比野生型和FKBP12.6基因敲除小鼠中cADPR对膀胱平滑肌细胞STOCs、钙火花及细胞内质网总钙含量的影响,探讨cADPR调节平滑肌细胞内质网中钙释放这一cADPR调控细胞钙瞬变发生关键环节的机制,为深入了解cADPR调控平滑肌细胞钙瞬变的机制提供实验依据。方法:本研究采用2-3月龄SD大鼠为研究对象。首先利用免疫荧光方法检测逼尿肌组织中ICCs细胞的分布及其与平滑肌细胞的关系。随后参照Hashitani等[18]的方法制作膀胱组织铺片,于记录Chamber底部Physiological saline生理液灌流保持肌条铺片活性。待肌条自发性收缩活动出现后,Fluo-4 AM负载肌条铺片,激光共聚焦显微镜观察铺片中平滑肌细胞和ICCs细胞自发性钙瞬变,随后分别观察L型、T型钙离子通道阻断剂Nimodipine、Nicl2,内质网IP3受体拮抗剂2-aminoethoxy diphenylborate （2-APB）,内质网RyR受体拮抗剂Ryanodine,内质网RyR受体激动剂Caffeine,内质网钙泵抑制剂Thapsigargin及无钙、高钙生理液对平滑肌细胞和ICCs细胞自发性钙瞬变的影响,探讨平滑肌细胞和ICCs细胞自发性钙瞬变产生、调控的机制。最后利用FKBP12.6基因敲除小鼠探讨cADPR调节膀胱平滑肌细胞内质网中钙释放的机制。通过PCR方法对敲除小鼠的基因表型进行鉴定。通过膜片钳记录cADPR对平滑肌细胞自发性瞬时外向电流（spontaneous transient out currents,STOCs）的影响,使用膜片钳和激光共聚焦显微镜共记录的方法,同步观察cADPR对平滑肌细胞STOCs和钙火花(Ca2+ spark)的影响。利用激光共聚焦显微镜观察cADPR对膀胱平滑肌细胞细胞钙火花特征的影响,并通过Thapsigargin预处理了解内质网钙泵是否参与cADPR调节平滑肌细胞中钙释放作用。利用Western blot实验,检测cADPR作用后,FKBP12.6从RyR2上释放入胞浆的情况。利用双Puff系统,通过瞬时使用10mM Caffeine,探讨cADPR对平滑肌细胞内质网中总钙含量的影响。结果:1. SD大鼠膀胱逼尿肌组织中存在ICCs细胞,ICCs细胞在逼尿肌肌束旁、肌束间和肌束内均有分布;ICCs细胞与平滑肌细胞、神经末梢在空间结构上紧密相邻;肌束旁和肌束间的ICCs细胞有时可连成一片,有可能成为相邻肌束之间联系的“桥梁”;2.逼尿肌组织铺片中平滑肌细胞自发性钙瞬变的特征如下:（1）逼尿肌组织铺片Fluo-4刚负载完成时,平滑肌束中平滑肌细胞自发性钙瞬变多不同步;热的生理液灌流20-30min后,平滑肌束中平滑肌细胞自发性钙瞬变趋于同步;（2）平滑肌细胞钙瞬变多起源于肌束边缘,而后传递到肌束的另一侧;部分钙瞬变可起源于肌束中部,而后向肌束两侧传递;（3）平滑肌细胞钙瞬变在肌束内纵向传递几乎无时间延迟,但其在肌束内横向传递有一定的时间延迟;（4）观察到相邻的肌束间可通过肌束间细胞进行钙瞬变的传递。3.成功同时记录到膀胱逼尿肌组织铺片中平滑肌细胞和肌束旁ICCs细胞的自发性钙瞬变,平滑肌细胞自发性钙瞬变频率相对较快,而肌束旁ICCs细胞的自发性钙瞬变频率相对较慢;4.膀胱逼尿肌组织铺片中的药理实验研究发现:（1） L型钙离子通道阻断剂Nimodipine能完全抑制平滑肌细胞的自发性钙瞬变,但对ICCs细胞的自发性钙瞬变无显著影响;T型钙离子通道阻断剂Nicl2可明显降低平滑肌细胞的自发性钙瞬变的频率,对平滑肌细胞钙瞬变的幅度及ICCs细胞的自发性钙瞬变无明显影响;（2） Ryanodine,Caffeine,2-APB,和Thapsigargin均可对平滑肌细胞的自发性钙瞬变产生显著的抑制作用,但不能完全消除平滑肌细胞的自发性钙瞬变的发生;（3） Ryanodine,Caffeine,2-APB,和Thapsigargin及无钙生理液均可完全抑制ICCs细胞的自发性钙瞬变,高钙生理液可显著增加ICCs细胞自发性钙瞬变的频率而降低其频率。5.成功对FKBP12.6基因敲除小鼠进行了基因表型鉴定。经鉴定,基因敲除小鼠繁殖后,表现为三种基因表型:纯合子（FKBP12.6 -/-）、杂合子（FKBP12.6 +/-）和野生型（FKBP12.6 +/+）;6. cADPR可显著增大野生型小鼠膀胱平滑肌细胞的STOCs,对FKBP12.6基因敲除小鼠（纯和子）平滑肌细胞STOCs却无明显影响;7.膜片钳和激光共聚焦显微镜共记录的研究结果发现,cADPR可显著增强野生型小鼠膀胱平滑肌细胞的STOCs及钙火花,但对FKBP12.6基因敲除小鼠平滑肌细胞STOCs及钙火花却无明显影响;8. cADPR对野生型小鼠膀胱平滑肌细胞钙火花有显著影响,而对FKBP12.6基因敲除小鼠平滑肌细胞钙火花却无明显调节作用。具体表现为:cADPR可显著提高野生型小鼠膀胱平滑肌细胞钙火花的频率、幅度及FWHM距离,明显延长其上升时间和半数衰减时间;而cADPR对FKBP12.6基因敲除小鼠细胞钙火花的上述特征性指标无明显影响;9.内质网钙泵抑制剂Thapsigargin对cADPR调节平滑肌细胞自发性钙释放的作用无明显影响;10. Western blot实验证实,cADPR可使FKBP12.6从RyR2上脱落下来,释放入胞浆中;11. cADPR可显著降低野生型小鼠膀胱平滑肌细胞内质网中的总钙含量,而对FKBP12.6基因敲除小鼠内质网中的总钙含量却无明显影响。结论:1.膀胱平滑肌自发性钙瞬变在肌束中纵向传递和横向传递的延迟不同可能来自传递机制的不同,而肌束间钙瞬变的传递增强可能参与DI的发生;2.热生理液灌流使肌束中平滑肌细胞自发性钙瞬变趋于同步及钙瞬变多起源于肌束边缘提示:膀胱逼尿肌组织中存在起搏细胞的可能性很大,可能是膀胱起搏细胞的是:①肌束一侧的平滑肌细胞和②肌束旁或肌束内ICCs细胞;钙瞬变也可起源于肌束中部,提示不同部位的膀胱平滑肌组织起搏细胞的分布可能存在差异;3.膀胱组织铺片中平滑肌细胞自发性钙瞬变频率明显快于肌束旁ICCs细胞,提示平滑肌细胞自发性钙瞬变起源于肌束旁ICCs细胞的可能性不大;考虑到目前肌束内ICCs细胞自发性钙瞬变尚不能进行检测,及目前技术手段对ICCs细胞自发性钙瞬变观察的限制,不排除肌束内和具有不同功能的肌束旁ICCs细胞是膀胱起搏细胞的可能性;4.细胞外钙通过L型钙离子通道入胞在平滑肌细胞自发性钙瞬变发生中起主要作用,而细胞内钙库中的钙释放入胞浆可能起辅助作用;Ca2+通过T型钙离子通道入胞则可影响细胞自发性钙瞬变的发生频率;5.细胞外钙通过非L型钙离子通道入胞及胞内钙库中的钙释放均参与ICCs细胞自发性钙瞬变的发生;参与ICCs细胞自发性钙瞬变发生的细胞膜上的非L型钙离子通道可能是①钠钙交换体NCX、②T型钙离子通道和③TRP（瞬时受体势）离子通道中的多个通道;6. cADPR调节平滑肌细胞内质网钙释放的机制是:使FKBP12.6从RyR2上脱落下来,导致RyR2通道开放明显增强,内质网中钙离子经RyR2通道释放入胞浆显著增加。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 逼尿肌细胞、ICCs 细胞自发性钙瞬变发生及调控机制的研究
• 前言
• 第一部分 ICCs 细胞在逼尿肌组织中的分布研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 逼尿肌组织中ICCs细胞、平滑肌细胞自发性钙瞬变特征的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 ICCs细胞、平滑肌细胞自发性钙瞬变发生机制的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第四部分 cADPR调节膀胱平滑肌细胞内质网钙释放作用机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述一 ICCs 细胞研究进展及与泌尿系统疾病的关系
• 参考文献
• 文献综述二 cADPR对平滑肌细胞钙释放及相关生理功能影响的研究进展
• 参考文献
• 攻读博士研究生期间发表论文情况
• 附件