普通小麦和短柄草微RNA的发现及番茄小分子RNA合成相关基因RDR1的功能研究

论文摘要

小分子RNA是植物中广泛存在的、长度约为20-30 nt的单链非编码RNA分子,它在植物的生长发育、适应各种外界胁迫以及维持基因组稳定性等方面起着非常重要的作用。通过大规模深度测序来挖掘主要农作物及其模式植物中重要的小分子RNA,分析它们的表达模式及功能,最终发现对农艺性状起关键作用的小分子RNA,是目前发现和研究作物小分子RNA的一条重要途径。另外,对植物小分子RNA生物合成途径中重要基因的突变体进行研究是明确它们在植物小分子RNA生物合成和植物发育等方面功能的重要途径。本文对普通小麦（Triticum aestivum L.）及其模式植物短柄草（Brachypodium distachyon L.）的小分子RNA进行了深度测序分析,挖掘和研究了普通小麦中重要的miRNA,并对番茄（Lycopersicum esculentum）LeRDR1基因及其RNAi植株进行了初步鉴定,为进一步研究番茄LeRDR1在小分子RNA生物合成及番茄发育等方面的功能奠定了基础。其主要研究结果包括:（1）为了寻找与小麦重要农艺性状相关的miRNA,我们以普通小麦中国春的根、茎、叶片以及幼穗为混合材料构建了一个小分子RNA文库。经Solexa测序后我们获得457,165条非冗余的小分子RNA序列。最终我们得到了属于25个家族的70个保守的小麦miRNA和属于33个新的植物miRNA家族的39个新型小麦miRNA。对miRNA的表达模式分析表明:小麦miRNA存在组织特异性表达的情况,其中tae-miR2015在小麦的根中特异表达。对miRNA靶基因进行预测表明小麦miRNA的靶基因包括转录因子和抗病基因类似物,其中tae-miR2009家族的两个成员tae-miR2009-a和tae-miR2009-c所预测到的靶基因与水稻的抗病基因同源,它们对靶基因的切割能力已用5′RACE实验得以证明。小麦小分子RNA可能在小麦应答各种胁迫方面起着重要的作用。（2）为了挖掘短柄草中重要的小分子RNA,我们分别以短柄草生殖组织和营养组织为材料构建了两个小分子RNA文库:BdR和BdV。经Solexa测序后分别得到了283,876和362,038条非冗余小分子RNA序列。利用现有的短柄草EST信息,我们得到了9个候选的短柄草特异miRNA家族共12个成员以及属于28个miRNA家族的共94个保守的短柄草miRNA成员。对这些新的和保守的miRNA进行了表达模式分析、靶基因预测分析以及RLM-5′RACE实验验证。通过比较分析短柄草营养生长阶段和生殖生长阶段相同miRNA的不同拷贝数,发现:同一家族的不同成员在短柄草的不同生长阶段表达量有所差异,并且同一miRNA家族在不同的物种中的表达量也不同。与24 nt的小分子RNA相比,21 nt长的小分子RNA在小麦、短柄草和水稻三个物种基因组上的分布更加保守。（3）为了研究番茄小分子RNA合成关键基因LeRDR1在番茄发育和番茄小分子RNA合成方面的具体功能,我们克隆了番茄中的LeRDR1基因,并分析它由4个外显子和3个内含子组成。组织特异性分析表明LeRDR1在番茄花序中的表达量远远高于其他组织。当LeRDR1基因被RNAi后,番茄花和果实的发育都受到影响,主要表现为花萼很大,子房发育畸形,严重植株出现了果实中长果实的现象。进一步检测表明在转基因植株的花萼中,SLMBP3、TAGL11和TAGL1三个MADS-box基因的表达量明显升高;而上述基因和SLMBP20在花瓣中的表达量也显著上调;TM4和TAGL1的表达量在转基因植株的第四轮花器官中都有所上调。这些基因表达量的增加可能是导致番茄花和果实表型的直接原因。下一步我们将对转基因植株和野生型番茄进行小分子RNA测序分析,分析小分子RNA与这些表型之间的关系。本文通过对小麦及其模式植物短柄草的小分子RNA进行深度测序分析,并对LeRDR1基因的功能进行了初步研究,为麦类植物以及番茄小分子RNA的深入研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 植物 miRNA
• 1.1.1 miRNA的生物合成
• 1.1.2 植物miRNA的作用方式
• 1.1.3 miRNA的起源与进化
• 1.1.4 植物miRNA的调控模式
• 1.1.5 植物miRNA鉴定标准
• 1.2 植物 siRNA
• 1.3 新技术对植物小分子RNA研究的推动
• 1.3.1 高通量测序技术对植物小分子RNA研究的促进
• 1.3.2 激光显微切割技术对植物小分子RNA研究的促进
• 1.4 植物小分子RNA合成路径重要酶的研究进展
• 1.4.1 RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-Dependent RNA polymerase, RDR）
• 1.4.2 Argnaute蛋白（AGO）
• 1.4.3 III型核糖核酸酶（DICER-LIKE, DCL）
• 1.5 研究内容、意义和技术路线
• 1.5.1 研究内容和意义
• 1.5.2 技术路线
• 第二章 普通小麦小分子RNA的克隆和深度测序分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 酶及其他实验耗材
• 2.1.3 试剂盒
• 2.1.4 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小麦小分子RNA提取
• 2.2.2 小分子RNA文库构建
• 2.2.3 生物信息学分析
• 2.2.4 小分子RNA Northern杂交
• 2.2.5 RNA连接酶介导的5′RACE（RNA ligase-mediated 5′RACE）
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 小麦小分子RNA序列分析
• 2.3.2 小麦小分子RNA的组成和相似性
• 2.3.3 小麦miRNA
• 2.3.4 小麦miRNA的表达分析
• 2.3.5 小麦miRNA的靶基因预测及验证
• 2.3.6 小麦中能够产生小分子RNA的编码基因
• 第三章 短柄草小分子RNA的克隆和深度测序分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 菌株和载体
• 3.1.4 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 短柄草小分子RNA序列分析
• 3.2.2 短柄草小分子RNA组成
• 3.2.3 短柄草miRNA
• 3.2.4 短柄草miRNA的表达分析
• 3.2.5 短柄草miRNA靶基因预测及验证
• 3.2.6 短柄草miRNA在营养生长和生殖生长阶段的差异表达
• 3.2.7 小分子RNA在小麦、短柄草和水稻基因组序列上的分布
• 3.3 讨论
• 3.3.1 小麦和短柄草的小分子RNA
• 3.3.2 小麦和短柄草中miRNA的保守和分化
• 3.3.3 小麦和短柄草小分子RNA的基因组分布
• 第四章 番茄小分子 RNA 合成关键基因 RNA 依赖的 RNA 聚合 酶 1（RNA-Dependent RNA polymerase1, RDR1）的功能研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 酶及其它试剂耗材
• 4.1.3 载体和菌株
• 4.1.4 试剂盒
• 4.1.5 引物
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 目标基因cDNA的获得及载体构建
• 4.2.2 番茄转化
• 4.2.3 RNAi转基因植株鉴定
• 4.2.4 RNAi转基因植株小分子RNA鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 目标基因序列分析
• 4.3.2 LeRDR1 基因的RNAi载体构建
• 4.3.3 LeRDR1 基因RNAi植株的分子鉴定
• 4.3.4 LeRDR1 基因RNAi植株的表型鉴定
• 4.3.5 LeRDR1 RNAi植株中与表型相关基因的表达量的变化
• 4.4 讨论
• 第五章 全文结论
• 5.1 普通小麦小分子RNA的克隆和深度测序分析
• 5.2 短柄草小分子RNA的克隆和深度测序分析
• 5.3 番茄小分子RNA合成关键基因RNA依赖的RNA聚合酶的功能研究
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历