论文摘要
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种机会性致病原虫,能够感染包括人在内的所有哺乳动物,引起人兽共患寄生虫病。在机体免疫功能受累时,慢性感染或隐性感染阶段的弓形虫缓殖子迅速活化,可引起致命的危险,是弓形虫病防治的重点所在。但是弓形虫缓殖子寄生在宿主细胞内,常规抗生素治疗效果不理想,至今仍未找到治疗弓形虫慢性感染的有效措施。研究表明,无论是在有氧条件下分裂增殖的速殖子,还是无氧条件下处于相对静止的缓殖子,其能量几乎全部来源于糖类代谢。乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase,LDH）是糖类无氧酵解中催化丙酮酸和乳酸互相转换的酶,和辅酶NAD+的循环再利用密切相关,在无氧条件下弓形虫能量代谢中具有举足轻重的地位。研究发现弓形虫LDH的结构、理化特性、免疫学特性及酶促动力学等方面和人类LDH存在很大的差异。所以,LDH能够成为杀灭弓形虫药物的潜在作用靶点。同时对LDH转化的相关研究还有助于对弓形虫速殖子向缓殖子转换机制的理解。LDH2是刚地弓形虫RH株表达的两种乳酸脱氢酶同工酶中的一种,其mRNA仅在弓形虫缓殖子中检测到,其表达产物也只出现在缓殖子中;而LDH1的mRNA在速殖子和缓殖子中均有发现,但其表达产物只出现在速殖子中。序列分析表明两者核苷酸序列有64%一致,在蛋白水平二者约有71%的同源性,但在理化、免疫学特性和酶学方面等却有很大的差异。由此可以推测,在刚地弓形虫RH株中LDH两种同工酶之间的转换是一个阶段性的转变过程,LDH1被LDH2替代可能发生在速殖子向缓殖子转化的过程中。其具体的调节机制是发生在转录阶段还是转录后阶段,及其中的确切机制尚有待于实验进一步阐明。鉴于缓殖子阶段是弓形虫致病的重要阶段,且危害性大,而LDH是弓形虫缓殖子能量唯一来源——糖类无氧代谢的终末催化酶,因此,LDH的种类及活性与弓形虫缓殖子的生存和致病能力密切相关,对LDH2基因的研究显得尤为重要。为此,本课题进行了以下几方面的研究:第一部分弓形虫LDH2基因5′-侧翼序列的克隆研究目的:获取刚地弓形虫LDH2基因的5′-侧翼序列,为研究该基因的表达调控机制奠定基础。研究方法和结果:根据公用数据库的序列信息和文献资料设计合成引物,运用Thermal Asymmetric Interlaced PCR（TAIL-PCR）扩增刚地弓形虫LDH2基因的5′-侧翼序列,并TA克隆到pMD18-T载体中进行测序,得到一大小为993bp的弓形虫LDH2基因的5′-侧翼序列DNA片段。结论:成功克隆了刚地弓形虫LDH2基因的5′-侧翼序列并测序,为研究该基因的表达调控机制奠定了试验基础。第二部分弓形虫LDH2基因5′-侧翼序列生物信息学分析研究目的:对生物信息学在弓形虫LDH2基因转录调控研究中的应用进行初步的摸索与探讨。研究方法和结果:我们从多角度对LDH2基因5′-侧翼序列及编码区域进行生物信息学分析,总结前人对LDH2基因已有的研究成果,预测基因转录起始位点以及启动子的所在区域。在综合分析各方面的结果后,得出相关结论,并以此为依据,指导后续实验的进行。取得如下结果:1.MethPrimer对CpG岛的预测结果并不唯一。在LDH2基因全序列中,MethPrimer搜索到11个潜在的CpG岛位点,其中5个CpG岛位于起始密码子上游,表明LDH2基因编码序列的确与CpG岛相连。2.Promoterscan预测LDH2基因的候选启动子在输入序列的第320bp～509bp处（LDH2基因的-540bp～-351bp）,其得分是53.25,预设阈值为50.00。3.McPromoter预测在输入序列的第100bp和第600bp附近的序列有较高的得分,分别在0.02和0.03,但相对于预设阈值而言得分不是很高。而第600bp处的候选启动子与NNPP和Promoterscan的预测结果均有部分区域相重合。4.Promoter2.0分析结果为,在输入序列的第900bp处很有可能存在具有启动活性的序列,但是没有给出转录起始位点。5.NNPP得出唯一的分析结果,在输入序列的第326bp～376bp之间存在有启动子活性的序列,候选启动子的得分为0.98,远大于预设阈值0.80。该工具得出的候选启动子区域与Promoterscan分析得出的结果有部分区域重合,而NNPP的优势在于其所提供的启动子预测区间较短。其余的工具均未预测到具有启动活性的序列或可能存在的转录起始位点。结论:各种生物信息学分析工具对LDH2基因候选启动子区域的预测结果并不完全相同。综合所有的分析结果,我们成功地将启动子和转录起始位点定位于输入序列的第300bp～700bp区间（LDH2基因的-559bp～-160bp）。第三部分弓形虫LDH2基因候选启动子序列活性的测定研究目的:对生物信息学所预测的刚地弓形虫LDH2基因的候选启动子区域进行试验鉴定。研究方法和结果:PCR扩增LDH2基因的候选启动子区域和全长LDH2基因5′-侧翼序列,克隆到不含启动子和增强子的pTL3-Basic载体的萤火虫荧光素酶报告基因上游,以构建候选启动子报告基因表达载体,分别命名为pTL3-Lp和pTL3-993,用以检测候选启动子的相对启动活性。然后以PRL-Tg为内参照质粒,电转化刚地弓形虫RH株速殖子,利用不同pH值的培养基继续培养,分别得到弓形虫速殖子和缓殖子。收集弓形虫,通过双荧光素酶报告基因检测系统定量分析候选启动子在速殖子和缓殖子中的活性。荧光素酶检测结果为:pTL3-Lp在弓形虫速殖子中和缓殖子中的荧光素酶相对表达活性分别为0.054和0.053,与阴性对照pTL3-Basic（0.052和0.051）基本相同;阳性对照pTL3-Control的荧光素酶相对表达活性分别为1.753和1.802;pTL3-993在弓形虫速殖子中和缓殖子中的荧光素酶相对表达活性为0.052和2.572。结论:全长LDH2基因5′-侧翼序列在弓形虫速殖子中没有活性,而在缓殖子中有较强的启动活性;所检测的候选启动子片段在弓形虫速殖子中和缓殖子中均未表现出任何启动子活性。表明所克隆的LDH2基因5′-侧翼序列在弓形虫缓殖子中确具有启动子活性,而候选启动子片段不具有启动子活性。第四部分弓形虫LDH2基因核心启动子鉴定研究目的:确定弓形虫LDH2基因的核心启动子及转录起始位点,对该基因转录调控进行初步研究,为深入探讨该基因的表达调控机制奠定基础。研究方法和结果:由于根据生物信息学分析所得出的候选启动子区没有检测到启动活性,本部分利用传统方法构建一系列巢式缺失突变体,构建系列突变体的报告基因表达载体,继而检测各缺失突变体的转录激活活性。引物延伸实验确定LDH2基因的转录起始位点。取得如下结果:1.所有系列缺失突变体PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,均为单一条带,无其它杂带,且所得片段大小与预期一致。2.5′-侧翼序列系列截短突变体荧光素酶表达载体经单、双酶切及测序鉴定正确。3.所有系列截短突变体在弓形虫速殖子中的均没有检测到活性。而包含-259bp～+134bp区域的截短突变体在弓形虫缓殖子中的荧光素酶活性约是阴性对照pTL3-Basic的50倍之多,是阳性对照pTL3-Control的1.5倍左右;而缺少此区域的截短突变体荧光素酶活性和阴性对照pTL3-Basic基本相同。4.弓形虫LDH2基因的转录起始位点位于起始密码子ATG上游134bp处。结论:成功地将弓形虫LDH2基因的核心启动子定位于-259 bp～+1bp区间。第五部分弓形虫LDH2基因顺式作用元件的初步分析研究目的:对弓形虫LDH2基因核心启动子区的顺式作用元件进行了初步分析,为深入了解参与该基因转录调控的转录因子提供研究基础。研究方法和结果:运用凝胶阻滞实验（EMSA）对弓形虫LDH2基因核心启动区是否存在顺式作用元件进行了初步分析。弓形虫速殖子、缓殖子核蛋白提取物与核心启动子区结合后,经5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,较未结合核蛋白提取物的靶序列位置明显滞后。随着反应体系中核蛋白提取物量的增加,滞后距离亦逐渐增加。而弓形虫速殖子、缓殖子核蛋白提取物与靶序列结合后,在凝胶上的位置不同,靶序列滞后程度亦不尽相同。此种结合可被未标记的冷探针竞争,而不被poly（dI:dC）竞争抑制,表明靶序列与核蛋白提取物结合的特异性。以上结果表明弓形虫速殖子、缓殖子核蛋白提取物中存在某种或者某些蛋白质因子与靶序列直接或间接结合,且弓形虫速殖子、缓殖子核蛋白提取物与靶序列的结合能力不同或者是与靶序列结合的蛋白因子不同。结论:弓形虫LDH2基因核心启动子区存在顺式作用元件,且弓形虫速殖子和缓殖子核蛋白提取物有蛋白质因子与之特异性结合。
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相关论文文献
- [1].弓形虫乳酸脱氢酶LDH2基因启动子的克隆及鉴定[J]. 中国人兽共患病学报 2013(04)