乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建及其在烟草和番茄中的表达

论文摘要

乙型肝炎是一种严重危害人类健康的全球性疾病,接种乙肝疫苗是目前预防乙肝病毒（HBV）感染的主要措施。乙肝病毒表面抗原（HBSAg）为HBV包膜蛋白的组分,不具感染性,是乙肝疫苗的有效成分。现行乙肝疫苗主要通过酵母表达系统得到,其生产工序复杂、需要专门的纯化设备和相应的技术人员,成本较高,从而限制了乙肝疫苗的广泛应用,而利用植物生产乙肝疫苗可有效弥补这一不足。因此,本实验构建了含乙肝病毒表面抗原基因的植物表达载体,并将其分别在烟草和番茄中成功进行了表达。本实验首先构建了植物表达载体pBRSAg,该载体具有完整的植物表达元件,具CaMV35S启动子、农杆菌T-DNA左右边界、植物报告基因gus和植物选择标记基因hpt,适用于根癌农杆菌的转化;其次将表达质粒导入农杆菌,用于对烟草外植体的遗传转化,获得的抗性植株经检测,结果表明乙肝病毒表面抗原基因在烟草中得到表达;最后,将HBSAg基因用于番茄的遗传转化,其间建立了番茄再生体系以及番茄遗传转化体系,获得的抗性植株经检测,证明HBSAg基因在番茄植株中也同样获得了表达,这为利用转基因番茄生产口服疫苗提供了一定的理论指导和实验基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 转基因植物疫苗
• 1.1.1 利用转基因植物生产疫苗的可行性
• 1.1.2 转基因植物疫苗的研究进展
• 1.1.3 转基因植物疫苗的优势及前景
• 1.2 乙肝病毒表面抗原基因植物疫苗研究
• 1.2.1 HBV病毒的分子结构
• 1.2.2 HBSAg基因的结构
• 1.2.3 转乙肝表面抗原基因植物疫苗的研究及进展
• 1.2.4 转乙肝表面抗原基因植物疫苗的问题及对策
• 1.3 转基因番茄研究进展
• 1.3.1 转基因抗病毒番茄研究
• 1.3.2 转基因抗菌番茄研究
• 1.3.3 转基因疫苗番茄研究
• 1.3.4 转基因延熟番茄研究
• 1.3.5 转基因抗虫番茄研究
• 1.3.6 改善番茄品质研究
• 1.3.7 转基因抗逆性番茄研究
• 1.3.8 转基因抗除草剂番茄研究
• 1.3.9 转基因雄性不育番茄研究
• 1.4 研究意义与内容
• 1.4.1 研究意义
• 1.4.2 研究内容
• 第2章 植物表达载体的构建
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要工具酶和试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 质粒提取液
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 质粒DNA的制备
• 2.2.2 酶切
• 2.2.3 片段的回收
• 2.2.4 DNA片段的连接
• 2.2.5 转化及重组子的筛选与鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 植物表达载体的构建
• 2.3.2 植物表达载体的酶切鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 植物表达载体的构建
• 2.4.2 载体构建中筛选抗性基因Hpt的应用
• 2.4.3 载体构建中植物表达启动子的选择
• 第3章 乙肝病毒表面抗原基因对烟草的转化及其表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 植物材料
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 烟草组织培养及转化培养基
• 3.2 实验方法与步骤
• 3.2.1 三亲交配法转化农杆菌
• 3.2.2 无菌烟草苗的获得
• 3.2.3 农杆菌介导转化烟草
• 3.2.4 转基因烟草的GUS组织化学染色
• 3.2.5 转基因烟草的分子生物学检测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 目的基因质粒导入农杆菌LBA4404
• 3.3.2 农杆菌介导的烟草转化的筛选培养
• 3.3.3 转基因烟草的继代培养与生根培养
• 3.3.4 转基因植株的GUS组织化学染色
• 3.3.5 PCR鉴定
• 3.4 讨论
• 第4章 乙肝病毒表面抗原基因对番茄的转化及其表达
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 植物材料
• 4.1.3 主要药品和试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.1.5 番茄组织培养及转化培养基
• 4.2 实验方法与步骤
• 4.2.1 冻融法转化农杆菌
• 4.2.2 番茄无菌苗的获得
• 4.2.3 番茄组织培养再生体系
• 4.2.4 番茄转化体系
• 4.2.5 转基因番茄的GUS组织染色检测
• 4.2.6 转基因番茄的PCR扩增检测
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 番茄再生系统的建立
• 4.3.2 影响番茄转化的因素
• 4.3.3 转基因番茄抗性植株的获得
• 4.3.4 转基因番茄的鉴定
• 4.4 讨论
• 4.4.1 转化中番茄受体材料的选择
• 4.4.2 转化中菌株的选择
• 4.4.3 转化中菌株浓度及侵染时间的选择
• 4.4.4 乙酰丁香酮（AS）在转化中的应用
• 4.4.5 番茄转化中抗生素的选择
• 4.4.6 番茄的生根培养
• 4.4.7 转化中番茄的褐化和玻璃化问题
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历