双孢蘑菇乙烯生物合成途径及与覆土出菇的关系研究

论文摘要

双孢蘑菇在世界上栽培范围最广,栽培规模最大。然而,栽培双孢蘑菇时必须覆土,否则很少或不能出菇,其机理还不清楚。本研究通过对双孢蘑菇乙烯生物合成途径的解析,初步探讨了双孢蘑菇覆土出菇的机理。主要结果如下:1、分别采用气相色谱法和离子色谱法测定了双孢蘑菇培养过程中合成的乙烯和ACC（1-氨基-环丙烷-1-羧酸）的量,在PDA液体培养基摇瓶培养和二次发酵培养料中培养15天后,在无菌条件下通气12小时,再密封6小时后测定乙烯合成速率,分别为9.26μl/L.h和5.92μl/L.h,液体培养15天后每克干菌丝体中的ACC含量是13.76μg。另外,100nmol/L～400 nmol/L浓度的乙烯能够显著抑制双孢蘑菇菌丝的生长。2、双孢蘑菇在PDA液体培养液中培养15天后,再加入L-Met和ACC溶液,使其终浓度达到5mmol/L,培养12h后,提取粗酶液,测定酶活性。酶活测定结果表明:L-Met和ACC溶液处理样品的ACS（ACC合成酶）的活性（单位为nmol/mg.h ）分别为9.81和1.94,对照是0.84。前两者是对照的11.68倍和2.31倍,三者之间有显著性差异（p﹤0.05）;L-Met、ACC溶液处理和对照中的ACO（ACC氧化酶）的体内酶活性（单位为nmol/mg.h）分别为0.72、3.14、0.89。ACC溶液处理与对照、L-Met溶液处理之间有显著性差异（p﹤0.05）,而对照和L-Met溶液处理之间却差异不明显;L-Met、ACC溶液处理和对照中的ACO的体外酶活性（单位为nmol/mg.h）分别为0.23、0.96、0.27,与体内测定结果规律一致。但是由于体外酶活测定中,可能导致部分酶活丧失,所以无论是对照,还是加入L-Met和ACC溶液的处理,其ACC氧化酶的体内酶活性都要比体外酶活性高的多,前者分别是后者的3.30倍,3.13倍和3.27倍。双孢蘑菇在PDA液体培养液中培养15天后,提取粗酶液,再加入AOA（氨基氧乙酸）和CoCl2（氯化钴）溶液使终浓度为5mmol/L,温育30min后,测定酶活性。酶活测定结果表明:AOA和CoCl2处理样品的ACC合成酶的活性（单位为nmol/mg.h ）分别为0.888和1.728,分别是对照2.184的2/5和4/5,其中AOA处理的样品和对照有显著性差异（p﹤0.05）,说明AOA对ACC合成酶有抑制作用;AOA和CoCl2处理样品的ACC氧化酶的活性（单位为nmol/mg.h ）分别为0.835和0.192,而对照为2.225,分别为前两者的2.7和11.6倍,加抑制剂的两个处理和对照有显著性的差异（p﹤0.05）,说明AOA和CoCl2均对ACC氧化酶有抑制作用,但是后者的抑制作用更强烈。3、根据GeneBank中真菌和高等植物的ACS和ACO基因的保守序列分别设计PCR引物,通过RT-PCR等方法克隆得到这两个基因,经过序列同源性比对,ACS基因序列与双孢蘑菇菌株Agabi. H97-2、Agabi.JB137-S8的ACS基因的同源性都达到了98%以上,ACO基因序列的同源性达到99%以上。4、覆土中能够利用ACC为唯一N源的细菌数量占细菌总数的28.5%。对其中优势菌群进行16SrDNA序列分析,除假单胞菌属（Pseudomonas）外,还包括Serratia rubidaea菌,Klebsiella pneumoniae菌和Bacillus cereus菌。这些细菌均有ACC脱氨酶基因,部分菌株的酶活力可达对照菌株（实验室保存的假单胞菌属131菌株）的118%。5、灭菌覆土中添加ACC脱氨酶产生菌恶臭假单胞菌UW4（P. putida UW4）,首潮和二潮出菇时原基形成数分别达到248个/m2和84个/m2,远高于或相当于未灭菌覆土（分别是184个/m2和88个/m2）,而灭菌覆土或灭菌覆土中添加UW4菌株的ACC脱氨酶突变株UW4-AcdS-首潮出菇时原基形成数仅为24个/m2和12个/m2,二潮出菇原基形成数仅为40个/m2和16个/m2。综上所述,在双孢蘑菇中存在有由甲硫氨酸经ACC合成乙烯的途径,乙烯对其菌丝生长有抑制作用。覆土中的优势菌是ACC脱氨酶产生菌。在灭菌覆土中添加ACC脱氨酶产生菌能够促进子实体的形成,而添加ACC脱氨酶缺失突变株则对双孢蘑菇子实体的形成没有促进作用。所以,双孢蘑菇覆土出菇的机理可能是,培养料中菌丝产生的ACC通过毛细管作用或扩散作用移动到覆土中,被覆土中的ACC脱氨酶产生菌所利用,减少了双孢蘑菇乙烯的合成,从而解除乙烯对双孢蘑菇菌丝生长和子实体形成的抑制作用。

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致谢

摘要

1 文献综述

1.1 双孢蘑菇栽培历史及发展概况

1.2 双孢蘑菇的发育机理

1.2.1 双孢蘑菇的生活史

1.2.2 双孢蘑菇的形态特征和生长过程中的生理生化要求

1.2.3 双孢蘑菇由营养生长转向生殖生长的必要条件

1.3 双孢蘑菇覆土出菇机理的研究进展

1.4 乙烯的生物合成途径和生物作用机理

1.4.1 乙烯的生物合成途径的类型

1.4.2 乙烯的生理作用

1.4.3 乙烯的作用机理

1.4.4 乙烯的信号传导

1.4.5 乙烯作用抑制剂的研究进展

1.5 双孢蘑菇中乙烯代谢途径的研究进展

2 引言

3 材料与方法

3.1 实验材料与仪器

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验仪器

3.1.4 主要培养基

3.1.4.1 牛肉膏蛋白胨培养基

3.1.4.2 马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基

3.1.4.3 马铃薯葡萄糖液体培养基

3.1.4.4 DF 盐液体培养基

3.1.4.5 改变氮源的DF 盐液体培养基

3.1.4.6 改变氮源的DF 盐固体培养基

3.1.4.7 TSB 培养基

3.1.4.8 LB 培养基

3.1.4.9 双孢蘑菇栽培试验培养料的配方

3.2 实验方法

3.2.1 双孢蘑菇培养料和覆土中细菌的计数方法

3.2.2 能在改变氮源的DF 盐固体培养基生长的菌种的分离、纯化和鉴定

3.2.2.1 菌种的分离纯化

3.2.2.2 根据生理生化特性鉴定菌种（经典方法）

3.2.2.3 16S1DNA 鉴定（分子生物学方法）

3.2.2.4 鉴定后菌种的ACC脱氨酶基因的克隆

3.2.2.5 鉴定后菌种的ACC脱氨酶活性测定

3.2.3 双孢蘑菇经ACC 产生乙烯相关物质测定和酶基因克隆、酶活性测定

3.2.3.1 双孢蘑菇产生乙烯的测定方法

3.2.3.2 双孢蘑菇中ACC 的测定方法

3.2.3.3 ACC 合成酶活性测定

3.2.3.4 ACC 氧化酶体内活性测定

3.2.3.5 ACC 氧化酶体外活性测定

3.2.3.6 双孢蘑菇总RNA 的提取

4 结果与分析

4.1 双孢蘑菇培养料和覆土在栽培的各时期细菌与ACC 降解菌变化趋势

4.1.1 双孢蘑菇培养料在栽培各个时期细菌与ACC 降解菌变化趋势

4.1.2 双孢蘑菇覆土在栽培各个时期细菌与ACC 降解菌变化趋势

4.2 双孢蘑菇灭菌覆土中添加ACC 降解菌对出菇的影响

4.3 覆土中ACC 降解菌的分离纯化和菌株鉴定

4.4 覆土中ACC 降解菌的ACC 脱氨酶基因克隆

4.5 覆土中ACC 降解菌酶活力的检测结果

4.6 双孢蘑菇生长过程中ACC 和乙烯产生量的测定结果

4.6.1 乙烯含量的测定

4.6.1.1 乙烯标准曲线的制定

4.6.1.2 双孢蘑菇在不同培养基中产乙烯的量

4.6.1.3 双孢蘑菇在不同培养基中生长过程中乙烯产量分析实验

4.6.1.4 乙烯对双孢蘑菇生长速度的影响

4.6.2 ACC 含量的测定

4.6.2.1 ACC标准曲线的制定

4.6.2.2 双孢蘑菇在PDA 液体培养基中ACC 产量分析实验

4.6.3 乙烯前体物和抑制剂对双孢蘑菇 ACC 合成酶和氧化酶活性的影响

4.6.3.1 乙烯前体物对 ACC 合成酶和氧化酶活性影响

4.6.3.2 双孢蘑菇ACC 合成酶和氧化酶抑制剂对其酶活性的影响

4.6.4 双孢蘑菇中ACC 合成酶和氧化酶的克隆

4.6.4.1 双孢蘑菇ACC 合成酶基因1（ACS1）的克隆及序列分析

4.6.4.2 双孢蘑菇ACC 合成酶基因2（ACS2）的克隆及序列分析

4.6.4.3 双孢蘑菇ACC 氧化酶基因的克隆及序列分析

5. 结论与讨论

5.1 双孢蘑菇出菇时覆土中优势菌种鉴定及其在覆土中的重要作用

5.2 双孢蘑菇中乙烯的 ACC 代谢途径的研究及其意义

6 参考文献

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