肝癌靶向性复制缺陷型腺病毒的构建及其作用研究

论文摘要

肝癌是严重危害我国人群健康的主要肿瘤之一,因其传统手术、放疗、化疗效果均不甚理想,基因治疗策略被认为具有良好的应用前景。而基因治疗需要面对的一个首要问题即为其作用的靶向性或特异性。目前,研究者普遍采用的方法即利用组织特异性调控元件特异启动治疗基因在相应组织中的表达。甲胎蛋白在大多数原发性肝细胞癌患者血清中均明显升高,甲胎蛋白启动子已广泛应用于肝癌的靶向性基因治疗中。研究已证实,人原发性肝癌中存在着高频率的p16基因失活,其中p16的5’CpG岛甲基化及纯合性缺失发生频繁。因此,将外源性p16基因导入肝癌细胞中,有可能恢复p16对细胞增殖的抑制作用、促进细胞凋亡、抑制肿瘤的发生发展。 本研究利用AdEasy XL Adenoviral Vector System,将外源性p16基因分别置于人α-甲胎蛋白核心启动子AF0.3、CMV启动子及HREAF杂合启动子下游,插入穿梭载体质粒中,再将线性化的穿梭质粒分别转化BJ5183-AD-1细菌,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌内进行同源重组产生出重组腺病毒载体质粒,经PacⅠ酶切暴露左右两端ITR后,分别转染HEK293细胞,构建、包装出携带外源性p16基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-CMV-p16、Ad-AFP-p16、Ad-HREAF-p16和AdTrack-CMV-p16。 选择纯化的重组腺病毒Ad-AFP-p16作为目标病毒,感染人肝癌细胞系HepG2和Bel-7402,经MTI比色实验、Western Blotting检测,证实体外感染Ad-AFP-p16的HepG2和Bel-7402可高效表达P16蛋白,细胞生长受到明显抑制,而人正常肝细胞LO2及非肝癌细胞在感染Ad-AFP-p16后生长未受明显抑制。进一步经流式细胞术分析、DNA片断化分析及Hoechst 33258核染色,显示Ad-AFP-p16可特异诱导肝癌细胞发生凋亡,而感染Ad-AFP-p16的人正常肝细胞LO2未见明显凋亡。经体内初步试验亦可看出,Ad-AFP-p16对小鼠肝癌细胞株H22的体内成瘤具有一定的抑制作用。 研究结果表明,Ad-AFP-p16可利用AFP启动子AF0.3驱动p16基因在肝癌细胞内特异性表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡,说明其在肝癌靶向性基因治疗中具有潜在的应用前景。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 携带目的基因的穿梭质粒的构建
• 1.目的基因的克隆
• 2.穿梭质粒的构建及鉴定
• 3.讨论
• 4.参考文献
• 第二部分 重组复制缺陷型腺病毒的构建及包装
• 1.细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒
• 2.重组复制缺陷型腺病毒的产生
• 3.讨论
• 4.参考文献
• 第三部分 重组复制缺陷型腺病毒的鉴定及纯化
• 1.重组腺病毒的噬斑分离纯化及鉴定
• 2.重组腺病毒滴度测定
• 3.讨论
• 4.参考文献
• 第四部分 重组腺病毒Ad-AFP-p16对肝癌细胞的特异抑制作用
• 1.Ad-AFP-p16体外特异诱导肝癌细胞的凋亡
• 2.Ad-AFP-p16的体内抑瘤作用初步研究
• 3.讨论
• 4.参考文献
• 总结
• 致谢
• 文献综述（一）
• 文献综述（二）
• 在学期间发表文章