果蝇中一个新基因ecp的功能鉴定与分析

论文摘要

我们从野生型黑腹果蝇胚胎cDNA文库中筛选并克隆得到ecp全长cDNA序列。生物信息学分析表明:ECP在进化过程中是十分保守的,从果蝇、斑马鱼到哺乳动物中均有其同源蛋白存在。从结构方面来看,ECP在其氨基端带有一个亮氨酸拉链结构基序,羧基端带有一个eIF5C结构域。这一结构域是eIF5与eIF2β的结合位点,因而ECP可能与eIF2β相互作用进而参与翻译过程。RNA原位杂交及胚胎抗体染色的结果都表明:在果蝇胚胎中,ecp无论在RNA水平上,还是在蛋白水平上都呈现广泛表达和分布,没有明显的组织特异性。Western Blot结果表明,ECP在果蝇的胚胎、幼虫、蛹及成虫中都有持续的高表达。这些结果提示ecp可能是一个管家基因。GFP标记分析及S2细胞免疫荧光结果显示,ECP主要分布在细胞质中,推测其可能通过与eIF2β相互作用而参与翻译过程。Western Blot分析发现, ECP蛋白在果蝇中存在两种迁移率不同的形式,ECP-S和ECP-F。从这两种形式在果蝇不同发育阶段所呈现的切换规律,即:胚胎、蛹和成虫都主要表达电泳迁移率较慢的形式（ECP-S）,伴随着果蝇胚胎孵化成幼虫时即开始表达迁移率较快的形式（ECP-F）,并持续到三龄幼虫开始蛹化时又逐渐被ECP-S替代,这些结果表明ECP-F可能与幼虫的生长发育有关。通过免疫共沉淀分析发现多种核糖体大小亚基蛋白能被抗ECP单抗所沉淀。与此同时,蔗糖密度梯度离心的结果也表明:有部分ECP能与40S、60S核糖体亚基结合。通过酵母双杂交,我们找到了两个可能与ECP相互作用的蛋白质, eIF2β和RPL5。这些结果表明ECP可能是一种核糖体相关蛋白,又因其可以和翻译起始因子eIF2β相互作用,因而ECP可能在翻译起始过程中起某种作用。S35-Methionine掺入实验表明,通过RNAi抑制S2细胞中ECP的表达后,蛋白质合成速率下降约45%。另一方面,在ecp的第一个内含子带有P因子插入突变的果蝇l（3）03022表现为短刚毛,生长发育迟缓,翅膀变小,隐性致死等典型的minute表型。这些结果进一步支持ECP可能参与蛋白质生物合成的推论。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 主要缩略词表
• 第一章 文献综述：——翻译起始机制及其调控研究进展
• 第一节 原核生物翻译起始研究进展
• 第二节 真核生物翻译起始研究进展
• 第三节 果蝇与翻译研究
• 展望
• 综述参考文献
• 第二章 实验材料与方法
• 一、实验材料及试剂
• 二、实验方法
• 第三章 结果与讨论
• 第一节 生物信息学分析表明ecp 可能参与翻译过程
• 第二节 ECP 抗体的制备
• 第三节 ECP 在果蝇中持续广泛表达并可能参与果蝇幼虫发育调控
• 第四节 ECP 是一个细胞质蛋白
• 第五节 ECP 是一个核糖体相关蛋白
• 第六节 ECP 与eIF2β及RPL5 相互作用
• 第七节 下调ECP 表达导致翻译效率降低
• 结论
• 参考文献（结果与讨论部分）
• 致谢
• 作者简介