论文摘要
第一部分持续惊厥后大鼠海马神经再生与凋亡的动态变化目的:探讨惊厥持续状态（status convulsion,SC）后大鼠海马神经再生与凋亡的动态变化。方法:建立成年Wistar鼠30 min SC模型,在SC后1天至56天的6个时间点上处死动物,处死前1天均腹腔注射5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo 2-deoxyuridine, BrdU）;采用免疫组织化学方法动态检测BrdU、nestin的表达,确定神经干细胞（neural progenitor/stem cells, NPCs）增殖水平;双重荧光染色标记nestin/TUNEL,确定新生神经干细胞存活状态。结果:正常成年鼠海马区,存在少量BrdU阳性细胞;SC后1天,CA1区和齿状回的BrdU阳性细胞即开始显著升高,与对照组相比,BrdU阳性细胞数目于SC后第7天在CA1区达增殖高峰,28天降至正常水平;于SC后第28天在齿状回达增殖高峰,56天降至正常水平;在SC后第7天,CA3区有大量的BrdU阳性细胞。BrdU和nestin阳性细胞的空间分布是一致的,阳性数目无统计学差异;在SC后的前3天,CA1区新增殖的神经细胞呈TUNEL阳性;齿状回新增殖细胞始终表现TUNEL阴性。结论:SC后能激活海马自体NPCs原位增殖,并且部分新生细胞可能向海马神经细胞损伤区域发生迁移。第二部分体外培养大鼠海马神经干细胞的兴奋性与电生理特征目的:观察体外分离培养大鼠海马神经干细胞（ neural progenitor/stem cells, NPCs）的兴奋性及电压门控通道表达。方法:无血清培养方法体外分离、纯化孕15～16天Wistar胎鼠的海马NPCs,nestin免疫荧光染色及血清促分化检测NPCs的干细胞特性;以接种于多聚赖氨酸包被玻片上624 h的第二代NPCs为研究对象,经DiBAC4（3）染色后,用含50μM KCl的细胞外液刺激,激光共聚焦扫描显微镜检测NPCs的膜兴奋性;采用膜片钳电流钳记录模式,记录NPCs的自发放电和动作电位;采用电压钳记录模式,检测NPCs的电压门控离子通道表达。结果:无血清培养基体外可获得高纯度的海马NPCs,形成神经球,可传代培养34代;NPCs表达干细胞标记蛋白nestin,且可分化为Tuj-1免疫反应阳性的神经元和GFAP免疫反应阳性的星形胶质细胞;接种于多聚赖氨酸包被的玻片上624小时的第二代NPCs仍表现干细胞特性;采用DiBAC4（3）染色,含高浓度钾的细胞外液刺激后,NPCs膜电位无显著改变;在电流钳模式下,未能检测到NPCs的自发放电,未能诱发动作电位;在电压钳模式下,未记录到NPCs的钠电流,但记录到到外向延迟整流钾电流及外向瞬时钾电流两种钾电流。结论:采用无血清培养方法,在体外成功分离大鼠海马NPCs;大鼠海马NPCs不易兴奋,可能与其仅表达钾电流而无钠电流表达有关。第三部分脑源性神经营养因子对海马神经干细胞存活、增殖及分化的影响目的:探讨脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）对海马神经干细胞（neural progenitor/stem cells, NPCs）的存活、增殖及分化的影响。方法:采用无血清培养基体外分离、纯化、扩增胎鼠海马NPCs。采用神经球计数及神经球直径测定观察BDNF对神经干细胞有无促增殖作用,并筛选出在适当细胞密度下,促进NPCs增殖的有效浓度;采用TUNEL染色及全自动生化分析仪测定细胞培养上清液乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase, LDH）的含量探讨BDNF对海马NPCs存活的影响;采用抗-Tuj-1染色检测NPCs分化成神经元的百分率,同时测定分化神经元突起的长度。结果:体外分离培养的海马NPCs表现为nestin免疫染色阳性,具有自我增殖能力,且能分化为神经元和星形胶质细胞;当细胞密度为5×105个/mL时,10200 ng/mL的BDNF能显著促进NPCs的增殖,其中40 ng/mL的BDNF促增殖作用最强;40ng/mL BDNF能显著增大神经球直径,显著减少NPCs的凋亡率（TUNEL+/DAPI+）,抑制LDH漏出。40 ng/mL BDNF也能显著促进NPCs分化为Tuj-1免疫染色阳性神经元,且分化后神经元的突起长度显著长于对照组。结论:BDNF促进海马NPCs的存活、增殖及向神经元方向分化。第四部分持续惊厥后海马内谷氨酸的动态变化及其对神经干细胞的作用目的:探讨惊厥持续状态（status convulsion,SC）后海马内谷氨酸（glutamate, Glu）含量的动态变化及其对海马神经干细胞（neural progenitor/stem cells, NPCs）的体外调控作用。方法:建立SC动物模型,在SC后1～7天内的3个时间点处死动物,高效液相色谱法检测海马内Glu含量的动态变化;体外分离、纯化海马NPCs,采用免疫荧光和Western blot检测N-甲基-D-天门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR）的必需亚单位NR1的表达;采用Fluo-3/AM钙成像技术及细胞单通道记录技术研究NPCs表达的NMDAR是否具有一定功能;采用TUNEL染色及全自动生化分析仪测定含不同浓度Glu和MK-801细胞培养上清液乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase, LDH）的含量,探讨NPCs上NMDAR激活是否介导神经兴奋毒性作用;采用神经球计数及神经球直径测定观察Glu对NPCs增殖的影响。结果:SC后1天,海马内的Glu含量即开始升高,在SC后第3天达高峰,SC后第7天降至正常水平;免疫荧光和Western blot的结果均显示NPCs表达NR1;NMDA刺激后,Fluo-3/AM Ca2+成像结果显示NPCs细胞内游离Ca2+含量明显升高,单通道细胞贴附式记录显示NPCs表达三种形式的电流:典型的单极矩形脉冲式发放、闪烁现象、爆发式开放和簇状开放;在30μM MK-801和01600μM Glu共7个实验组中,1600μM Glu组培养上清液中LDH显著增高,而其他各组无差别;各组的凋亡水平无显著差别;在30μM MK-801和01600μM Glu共七个实验组中,800μM Glu显著促进神经球数目的增多,而各组对神经球的直径无显著影响。结论:SC导致海马内Glu含量增加;海马NPCs表达功能性NMDAR;Glu促进NPCs增殖;NMDAR介导的Ca2+内流可能是Glu促进NPCs增殖的机制之一。
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