论文摘要
目的:树突状细胞（dendritic cell,DC）是人体内功能最强的抗原递呈细胞（antigen processing cell,APC）。在捕获肿瘤细胞后,DC迁移到淋巴结中将肿瘤抗原提呈给T淋巴细胞,诱导其成为肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）,后者特异性杀伤肿瘤细胞。肿瘤引流淋巴结（tumor-draining lymph node,TDLN）是位于肿瘤淋巴引流区的淋巴结,TDLN中含有丰富的淋巴细胞和单核细胞。本实验采取体外诱导培养乳腺癌患者引流区淋巴结细胞,经负载肿瘤抗原的DC激活后,使之成为肿瘤特异性CTL,并回输同体乳腺癌裸鼠模型中,研究自体肿瘤特异性CTL在裸鼠体内对肿瘤细胞的生长抑制和杀伤作用。方法:手术时无菌摘除乳腺癌引流区肉眼判断无转移淋巴结23枚及瘤组织一块,同时无菌切取另一患者瘤组织一块,用机械法获取淋巴细胞悬液,离心,以rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2和TNF-α诱导培养,定期观察细胞形态学变化,收集部分细胞进行流式细胞术（flow cytometry,FCM）分析,使之成为DC和肿瘤区域引流淋巴细胞（tumor-draining lymph node cell,TDLNC）,然后用自体乳腺癌冻融抗原刺激DC,并和TDLNC共培养,以诱导产生肿瘤抗原特异性CTL;同时将切取的患者乳腺癌组织剪成约1mm3大小种植于32只34周龄BALB/C裸鼠胸垫部皮下建成裸鼠乳腺癌模型,2周后将裸鼠随机分成共4组,每组8只。每5天注射一次,①特异性CTL组（每只裸鼠局部注射抗原特异性CTL 5×106/ml 0.2ml）②非特异性CTL组（每只裸鼠局部注射非特异性CTL 5×106/ml 0.2ml）③异体CTL组（种植另一患者乳腺癌组织,每只裸鼠局部注射非自体抗原特异性CTL 5×106/ml 0.2ml）④空白对照组（每只裸鼠局部注射生理盐水0.2ml）,每5天用游标卡尺测量记录肿瘤长径（a）、短径（b）,按体积（V）=πab2/6计算肿瘤体积,并计算肿瘤生长抑制率,统计分析移植瘤生长抑制情况。30天后处死裸鼠取出瘤块。将肿瘤组织放入福尔马林溶液中固定、脱水、石蜡包埋切片。常规HE染色,镜下观察肿瘤细胞形态;由病理医师诊断核实,免疫组化染色,观察T淋巴细胞和树突状细胞浸润情况。结果:1淋巴结单个核细胞经体外培养后,贴壁细胞在诱导前,DC的特异性表面标志物CD1a、CD83、CD86的百分比分别为10.98±2.38、26.55±5.24和32.96±6.09,经与rhGM-CSF、rhIL-4共同培养,并经自体肿瘤冻融抗原加TNF-α诱导后三种标志物的水平明显升高,分别为50.17±5.68、60.48±16.46和56.22±16.38,P<0.01;2 TDLNC中CD3+和CD8+细胞含量分别为73.93±2.18和32.78±3.21;经DC和肿瘤抗原诱导后,DC-Ag-TDLNC中的CD3+和CD8+细胞含量明显升高,分别为82.67±2.79和62.54±2.51,P<0.01;DC-TDLNC组分别为81.97±2.12和60.59±2.55,P<0.01;3人乳腺癌裸鼠移植瘤成活率为100%;4各治疗组对肿瘤的生长都有抑制作用,从第15天到第30天,空白对照组与各治疗组移植瘤体积都有显著性差异。移植瘤生长抑制以自体特异性CTL组最高,治疗15天后肿瘤体积平均达82.70±2.09mm3,小于非特异性CTL组（96.15±5.35mm3）和异体CTL组（96.93±4.51mm3）,差异有显著性（P =0.000）;自体特异性CTL组抑瘤率（47.62%）明显高于非特异性CTL组（30.44%）和异体CTL组（24.69%）抑瘤率,差异有显著性（P =0.000）;5移植瘤标本HE染色镜下证实为乳腺浸润性导管癌,治疗组瘤组织可见大量淋巴细胞浸润;治疗组标本免疫组化可见被染成棕黄色树突状细胞和大量淋巴细胞浸润于瘤组织中。结论:1乳腺癌患者腋下引流淋巴结细胞在rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α的诱导下,可以分化为典型的DC;2 DC具有较强的抗原提呈功能,可以促进TDLNC增殖、分化为抗原特异性CTL;3自体特异性CTL对裸鼠体内自体移植瘤有较高的抑制作用,为乳腺癌免疫治疗提供了理论依据;4病理证实移植瘤与人乳腺癌相符,且有DC和大量淋巴细胞浸润;5该方法建立乳腺癌裸鼠模型成功率高,可保持人乳腺癌生物学特性,为研究乳腺癌提供了重要工具。总之,本实验采用直接体外培养TDLNC的方法,得到大量对自体肿瘤有很强杀伤作用的CTL,并成功在裸鼠体内抑制自体移植瘤生长,对临床上乳腺癌细胞免疫治疗提供了理论依据。
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标签：乳腺癌论文; 肿瘤引流区淋巴结细胞论文; 树突状细胞论文; 特异性细胞毒淋巴细胞论文; 裸鼠模型论文; 免疫治疗论文;