直翅目部分物种的DNA条形编码与谱系芯片研究

论文摘要

直翅目（Orthoptera）昆虫是不完全变态类昆虫中唯一一个最大,且研究最多的类群,全世界已知约23000种,中国已知1500余种。关于直翅目昆虫的物种鉴定主要基于外部形态特征和外生殖器结构的差异,传统的分类方法存在不足。随着分子生物学技术的发展,一些基于DNA的技术在物种鉴定工作中逐渐应用。近几年,为了满足对地球上所有生物进行快速编目的需要,有人提出可以使用一小段来自某一特定基因组区域的DNA序列作为物种的特异性标签,即DNA条形码。利用特异性DNA条形码可以对未知标本进行快速划分和准确鉴定,这一新的物种诊断技术就是DNA条形编码,代表了生物分类学发展的新方向。另外,DNA芯片技术自身固有的快速、灵敏及高通量等优点,使其成为一种识别鉴定物种及确定阶元归属的理想工具。本研究利用测定的658bp的标准CO I条形码序列,结合GenBank中下载的相关序列,对中国直翅目蝗总科和螽斯总科部分物种的DNA条形编码和谱系芯片进行了初步研究。本研究涉及了蝗总科7科300种643个个体和螽斯总科9科160种548个个体,详细分析了83种的种内和种间成对遗传距离,确定了直翅目物种鉴定的条形码比较阈值,并对所有物种进行了NJ聚类分析,对自测物种进行了相似性搜索分析。基于条形码序列筛选了属特异性和物种特异性探针,获得的303条探针序列分别与各科的条形码序列进行虚拟杂交。本研究的主要结果如下：1.CO I条形码序列适合于直翅目物种水平的分子鉴定。蝗总科的种内变异水平在0-2.96%之间,种内平均遗传距离的变化范围在0.18-1.31%之间,明显小于3%,种间分歧的变化范围在4.09-20.69%；螽斯总科的种内变异水平在0-2.65%之间,种内平均遗传距离的变化范围在0-1.54%之间,种间的成对遗传距离的变化范围在4.90-23.90%之间。因此将3%作为直翅目DNA条形码比较的阈值合理可行。2.在本论文关于直翅目物种鉴定的研究中,基于BLAST搜索方法是一种更方便的物种分子鉴定方法。尽管基于溯祖理论的NJ聚类分析方法能够有效地将单一的形态物种聚为一支,但物种建树的方法受到计算上的限制。因此,基于CO I条形码序列的相似性搜索的方法是一种比及基于树的方法更为方便快捷的物种分子鉴定方法。3.直翅目CO I条形编码中,使用本课题组参考半变态昆虫CO I序列设计的条形码引物同时扩增出假基因（Numts）的概率很小。4.直翅目658bp CO I条形码获得物种特异性探针数量较少,且获得探针的识别率太低,实际应用价值不大。本研究中螽斯总科160个物种,仅97（约61%）个物种可以筛选得到特异性探针,蝗总科共300个物种,只有168（56%）个物种可以筛选出特异性探针。虚拟杂交结果显示,筛选获得的探针可以识别约73%（71/97）的螽斯总科物种；蝗总科中只有约51%（86/168）的物种可以识别到种或属,其中将55个物种鉴定到种,将31个物种鉴别到属级水平。因此,COI条形码分子标记不适合用于直翅目物种鉴定谱系芯片的构建。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1 基于DNA的主要物种鉴定技术概述
• 1.1 DNA杂交
• 1.2 限制性片段长度多态性（RFLPs）分析
• 1.3 扩增片段长度多态性分析（AFLPs）
• 1.4 随机扩增多态性DNA（RAPD）
• 1.5 常规PCR
• 1.6 实时定量PCR
• 1.7 PCR产物测序
• 1.8 DNA微阵列（DNA芯片）
• 2 DNA条形码编码
• 2.1 DNA条形编码的概念与原理
• 2.2 DNA条形编码产生的背景和意义
• 2.3 DNA条形编码研究现状
• 2.3.1 CBOL的主要计划
• 2.3.2 DNA条形编码在真菌和细菌鉴定中的应用
• 2.3.3 DNA条形编码在动物鉴定中的应用
• 2.3.4 DNA条形编码在植物鉴定中的应用
• 2.4 DNA条形编码的分析方法
• 2.4.1 相似性方法（Similarity approaches）
• 2.4.2 系统发育的方法（Phylogenetic approaches）
• 2.4.3 基于性状的方法（Character-based approaches）
• 2.4.4 谱系方法（Genealogical methods）
• 3 谱系芯片
• 3.1 基因芯片概念及分类
• 3.2 基因芯片技术在物种鉴定中的研究现状
• 3.2.1 基因芯片技术在微生物检测中的应用
• 3.2.2 基因芯片技术在动物物种鉴定中的应用
• 4 研究类群概述
• 4.1 直翅目昆虫的起源
• 4.2 直翅目高级阶元分类系统
• 4.2.1 蝗亚目的分类研究
• 4.2.2 螽亚目的分类研究
• 5 研究的目的及意义
• 第2章 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 标本的采集、保存与鉴定
• 1.2 实验试剂及仪器
• 1.2.1 实验试剂
• 1.2.2 实验仪器
• 1.3 生物学软件
• 2 实验流程及方法
• 2.1 基因组DNA提取方法
• 2.1.1 组织消化液的配制
• 2.1.2 基因组DNA提取方案及操作步骤
• 2.2 CO Ⅰ条形码片段的PCR扩增、纯化和测序
• 2.2.1 CO Ⅰ条形码片段的PCR扩增
• 2.2.2 PCR产物的分离纯化和测序
• 3 数据处理方法
• 3.1 数据准备
• 3.2 CO Ⅰ条形码分析
• 3.3 探针的筛选与虚拟杂交
• 3.3.1 物种特异性探针的筛选
• 3.3.2 探针与条形码序列的虚拟杂交
• 第3章 DNA条形编码的结果与分析
• 1 基因组DNA的提取与CO Ⅰ条形码序列的扩增测序
• 1.1 基因组DNA的提取
• 1.2 CO Ⅰ条形码序列的PCR扩增测序
• 2 DNA序列组成及变异分析
• 3 氨基酸序列位点变异分析
• 4 蝗总科Acridoidea物种的条形码分析
• 4.1 斑腿蝗科Catantopidae的条形码分析
• 4.2 斑翅蝗科Oedipodidae的条形码分析
• 5 螽斯总科Tettigonioidea物种的条形码分析
• 5.1 蛩螽科Meconematidae的条形码分析
• 5.2 草螽科Conocephalidae的条形码分析
• 5.3 螽斯科Tettigoniidae的条形码分析
• 5.4 露螽科Phaneropteridae的条形码分析
• 6 种内和种间成对遗传距离的分布频率及每个阈值的累积误差
• 7 Blast相似性搜索的结果与分析
• 7.1 Blast本地数据库的构建
• 7.2 Blast相似性搜索结果
• 8 直翅目部分物种的CO Ⅰ条形编码的可行性评估
• 第4章 物种特异性探针筛选及虚拟杂交结果分析
• 1 物种特异性探针筛选结果
• 2 探针序列在条形码序列上的分布
• 3 条形码序列与探针的虚拟杂交
• 3.1 露螽科物种的虚拟杂交结果与分析
• 3.2 草螽科虚拟杂交结果与分析
• 3.3 蛩螽科的虚拟杂交结果与分析
• 3.4 螽斯科的虚拟杂交结果与分析
• 3.5 纺织娘科、似织螽科、拟叶螽科、硕螽科和迟螽科的虚拟杂交结果与分析
• 3.6 斑腿蝗科的虚拟杂交结果与分析
• 3.7 斑翅蝗科的虚拟杂交结果与分析
• 3.8 网翅蝗科的虚拟杂交结果与分析
• 3.9 剑角蝗科、锥头蝗科、槌角蝗科和癞蝗科的虚拟杂交结果与分析
• 4 影响直翅目物种鉴定谱系芯片构建的因素分析
• 第5章 总结与结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ:蝗总科实验材料及从NCBI中下载的序列
• 附录Ⅱ:螽斯总科实验材料及从NCBI中下载的序列
• 致谢
• 攻读博士学位期间科研成果