产木聚糖酶菌株的筛选、鉴定及木聚糖酶的分离纯化

论文摘要

我国生物质资源丰富,通过生物转化法将生物质转化为能源,既清洁又环保,可部分替代化石能源,减少温室气体排放。生物质能源化主要包括生物质分解和生物质转化两个关键步骤。在生物质分解阶段,如何提高半纤维素分解效率是关键,选育高效分解半纤维素的菌株对生物质开发利用有重要意义。本试验先以自制蔗渣半纤维素为唯一碳源,从垃圾场土壤样品中分离到6株分解半纤维素的菌株,通过比较固态发酵产木聚糖酶活力,确定1株木聚糖酶活力较高的菌株。然后,以该菌株为研究对象,对该菌株的孢子和菌丝进行显微形态观察,发现其形态具有曲霉（Aspergillus sp.）特性。对该菌株18S rDNA序列进行分析,结果显示该菌株18S rDNA序列与曲霉的同源性达97%。根据菌株形态学分析和18S rDNA序列分析的结果,将该菌株鉴定为曲霉,并命名为曲霉（Aspergillus sp.）HQ3。通过对该菌株的固态发酵产酶条件研究,初步确定曲霉HQ3的最佳产酶条件为:甘蔗渣:麸皮为7∶3（W/W）,固液比为1∶4（W/W）,尿素0.4%,pH7.0,温度30℃,发酵产酶时间4 d。在最佳产酶条件下,其木聚糖酶活最高可达3421U/g干曲。为构建高产木聚糖酶的工程菌株,本试验对Aspergillus sp.HQ3产的木聚糖酶进行分离纯化并对其酶学性质进行研究。粗酶液经硫酸铵沉淀、PhenylSepharose 6 Fast Flow（High Sub）疏水层析、Sephadex S-200凝胶层析分离纯化后,得到一个木聚糖酶组分,该酶的最终收率为1%,纯化倍数为5.7。通过SDS-PAGE确定其分子量为33 kD左右。酶学研究表明该木聚糖酶的最适作用pH4.8,最适作用温度50℃。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 半纤维素
• 1.1.1 半纤维素的组成
• 1.1.2 木聚糖的结构
• 1.1.3 木聚糖的提取
• 1.2 木聚糖酶
• 1.2.1 木聚糖酶的来源
• 1.2.2 木聚糖酶的组成及性质
• 1.2.3 木聚糖酶的合成
• 1.2.4 木聚糖酶的应用
• 1.2.5 木聚糖酶的研究趋势
• 1.3 产木聚糖酶菌株的筛选及鉴定
• 1.3.1 产木聚糖酶的微生物
• 1.3.2 筛选产木聚糖酶的菌株
• 1.3.3 产木聚糖酶菌株鉴定
• 1.4 木聚糖酶的纯化与酶学性质
• 1.4.1 木聚糖酶的纯化
• 1.4.2 木聚糖酶的酶学性质
• 1.5 我国木聚糖酶的研究现状
• 1.6 本论文研究的内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种及引物
• 2.1.2 实验底物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 溶液配制
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 半纤维素的提取
• 2.2.2 产木聚糖酶的菌种筛选
• 2.2.3 产木聚糖酶的菌种鉴定
• 2.2.4 木聚糖酶的活力检测
• 2.2.5 菌株产酶条件优化
• 2.2.6 蛋白质含量的测定
• 2.2.7 蛋白质电泳分析
• 2.2.8 木聚糖酶的分离纯化
• 2.2.9 木聚糖酶的一般理化性质
• 3 结果与分析
• 3.1 产木聚糖酶的菌种筛选
• 3.2 产木聚糖酶的菌种鉴定
• 3.3 菌株产酶条件优化
• 3.3.1 麸皮含量对酶活力的影响
• 3.3.2 氮源对产酶的影响
• 3.3.3 固液比对酶活力的影响
• 3.3.4 发酵温度对酶活力影响
• 3.3.5 pH对酶活力的影响
• 3.3.6 发酵时间对酶活力的影响
• 3.3.7 曲霉HQ3最佳培养条件的确定
• 3.4 木聚糖酶的分离纯化
• 3.4.1 粗酶液制备及成分分析
• 3.4.2 硫酸铵沉淀
• 3.4.3 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（High Sub）疏水柱层析
• 3.4.4 Sephadex S-200分子筛层析
• 3.5 木聚糖酶的一般理化性质
• 3.5.1 pH对木聚糖酶的影响
• 3.5.2 温度对木聚糖酶的影响
• 4 讨论
• 4.1 产木聚糖酶的菌种筛选及鉴定
• 4.2 菌株发酵条件优化
• 4.3 木聚糖酶的分离纯化
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢