论文摘要
本试验室构建了带有枯草杆菌安舒克栓酶基因的质粒pUBH。该质粒在蛋白酶缺陷型表达受体菌DB403中能够实现正确表达枯草杆菌安舒克栓酶（Antithromboase, AT）。AT对纤维蛋白有直接的降解作用,有望成为一种新型的溶栓药物。但它还存在一些缺陷,例如酶活有待提高。 为了克服AT自身的缺点,需要对该分子进行改造。由于不能清楚的知道AT结构和功能之间的对应关系,因此不能通过分子设计对蛋白进行功能改造。而目前解决这一难题的有效方法是分子进化工程。该工程策略是:模拟蛋白质分子自然进化过程,在目的蛋白质的基因中引入随机突变,然后筛选出性状优良的突变体。 本研究采用了两种突变方法（化学诱变剂直接体外突变质粒DNA和碱基类似物PCR方法突变AT基因）来获得突变体;通过两级筛选方法（突变体粗筛和突变体复筛）获得性状优良的突变体,并对突变酶的性质进行了研究。 化学诱变剂种类繁多,作用机理各不相同。选择了两种作用机理不相同,又广泛使用的化学诱变剂——脱氨基诱变剂亚硝酸钠和烷基化诱变剂甲基磺酸乙酯（简称EMS）来突变质粒DNA。亚硝酸钠的突变作用原理是:亚硝酸钠直接作用于DNA,脱去碱基中的氨基变成酮基,改变碱基氢键的电位,引起转换而发生突变。亚硝酸钠突变质粒DNA,经过筛选获得酶活显著增加的突变体4个。筛选结果发现40mmol/L亚硝酸钠、反应温度37℃和反应时间1小时对于突变质粒DNA是有利的。甲基磺酸乙酯的突变原理是:在水分子作用下生成正碳离子,正碳离子很快与氨基起反应,改变碱基中的氨基,使氨基中氢不能和酮基形成正确的氢键,导致碱基配对错乱产生突变。甲基磺酸乙酯突变质粒DNA,经过筛选获得酶活显著增加的突变体5个。筛选结果表明0.7mol/LEMS、反应温度25℃和反应时间1小时对于突变质粒DNA是适当的。 碱基类似物PCR突变方法的原理:用化学诱变剂作用于四种dNTP混合物,使碱基上的氨基被脱去,形成碱基类似物,用Taq酶以该碱基类似物为底物扩增目的基因片断,由于Taq酶不具有保真性,因此在聚合的过程中,不但会产生错配,还会引入碱基类似物,由于碱基类似物存在,导致配对原则改变,导致在后续的复制过程中会增加突变的可能性。碱基类似物PCR方法扩增AT基因获得突变的供体片断,以自己构建的穿梭质粒pMA-AT作为载体,酶切连接（达到突变的AT基因代替正常的AT基因的目的）,先转化大肠杆菌;提取所有转化子的质粒,即为混合质粒（含有AT基因的各种突变）,再将混合质粒转化枯草杆菌。通过穿梭质粒和两次转化克服了重组质粒转化枯草杆菌效率低的障碍,获得了相当多的突变体,筛选获得了一个酶活显著提高的突变体。
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