论文摘要
1.大肠杆菌O157：H7多重PCR方法检测自肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7基因组扩增O157抗原基因rfbE和H7标志性基因fliC建立了二重PCR,扩增EHEC主要毒力因子志贺氏毒素1 （shiga toxin 1 stx1）、志贺氏毒素2 （shiga toxin 2 stx2）、溶血素（haemolysin hly）建立了三重PCR；并对其敏感性、特异性、重复性进行判定。结果显示二重PCR成功扩增812bp、609bp目的片段,三重PCR成功扩增593bp、484bp、319bp目的片段；所建立的二个多重PCR敏感性、特异性、重复性都很好。运用所建立的多重PCR对奶牛场63份粪便进行临床检测,其中4份为O157：H7阳性,阳性率为6.3%。经测序比较,与GenBank中公布的参考株EDL933序列（NC002655.2）同源性为99%。2.大肠杆菌O157：H7溶血素（hly）部分基因片段的克隆表达参照GenBank中大肠杆菌O157：H7（参考株EDL933）hly基因序列设计一对特异性引物,用PCR方法扩增hly部分基因,得到1732bp的片段,然后克隆到pMD18-T载体中,经测序比较,与GenBank中公布的序列（登录号X79839.1）核苷酸同源性为99%。从T载体中切下目的片段后,定向克隆到pET-32a（+）中,转化E.coli BL21（DE3）,经诱导后,进行SDS-PAGE试验,证明获得81kD融合蛋白,目的基因高效表达；免疫转印鉴定呈阳性,hly部分基因片段体外成功表达。并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白,纯化后蛋白纯度可达90%。3.大肠杆菌O157：H7溶血素蛋白BALB/C小鼠免疫试验通过基因工程技术成功表达的大肠杆菌O157：H7溶血素蛋白,与弗氏佐剂混合,免疫10只BALB/C小鼠,同时做6只试验对照组。三免后用100倍最小致死量的参考大肠杆菌O157：H7菌（100×109CFU）灌胃攻菌。结果对照组全部死亡,实验组保护率为60%。试验证实体外表达的大肠杆菌O157：H7的溶血素蛋白具有免疫原性,在抵抗大肠杆菌O157：H7的攻击中起到一定的保护作用。
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