论文摘要
目的E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG）是1998年Gill博士利用酵母双杂交技术克隆的一个转录调控相关因子。CREG基因可与外源性腺病毒蛋白E1A及哺乳动物体内转录因子E2F家族蛋白竞争性地结合在靶基因的启动子区,从而阻遏E1A蛋白和E2F对靶基因的转录,而E1A、E2F均具有促进细胞增殖的作用,所以CREG可能通过与E1A、E2F竞争性抑制作用而起到促进细胞分化、抑制细胞增殖的作用。本实验室前期研究发现,去血清能够诱导体外培养的人血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）从合成表型逆转为分化表型,同时CREG蛋白表达明显增加。大鼠颈动脉拉伤实验证实,CREG基因表达与VSMCs增殖能力呈负相关,推测其可能参与了VSMCs表型调控。Veal博士等证实CREG是一种分泌型糖蛋白,可以与胰岛素样生长因子II竞争性结合细胞膜胰岛素样生长因子受体II,以自分泌和旁分泌两种途径对细胞功能进行调控。为进一步明确CREG糖蛋白的功能,本研究采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白印迹（Western blot）及Ni-NTA亲和层析等方法表达、纯化重组hCREG糖蛋白,并用流式细胞周期分析、5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）掺入实验等方法验证重组人CREG（hCREG）糖蛋白具备抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞（Human internal thoracic artery-Shenyang, HITASY）增殖的生物学功能,为hCREG蛋白的工程化生产提供前期研究基础。方法①用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框并构建pcDNA3.1 myc-His/hCREG真核表达载体。②Lipofectamine 2000转染人293F细胞株并筛选稳定表达细胞克隆,Western blot方法鉴定hCREG/myc-His融合蛋白的表达,糖苷酶法及Western blotting行hCREG/myc-His融合蛋白的糖基化分析。③根据6×His亲和层析原理,应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白,纯化后蛋白通过HiTrap脱盐柱脱盐。④用流式细胞周期分析研究添加0.5μg /mL、1μg /mL及2μg /mL重组hCREG/myc-His融合糖蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。用BrdU掺入方法研究添加重组蛋白对体外培养HITASY细胞增殖的影响。结果RT-PCR扩增含终止密码突变的hCREG cDNA片段,经BamH I和EcoR I双酶切构建了pcDNA 3.1myc-His/hCREG真核表达载体,酶切及测序结果均证实构建的重组质粒正确。稳定表达pcDNA 3.1 myc-His/hCREG的293F细胞及未转染的对照细胞裂解产物,分别以Anti-hCREG、Anti-myc及Anti-His行Western blot检测。hCREG抗体可检测到转染组较对照组多两条约30KD的融合蛋白表达条带,myc抗体及His抗体均检测到大小约为30KD的融合蛋白表达。将稳定表达pcDNA 3.1 myc-His/hCREG的293F细胞裂解产物及经PNGaseF处理过的样品分别行Anti-hCREG、Anti-myc及Anti-His的Western blot检测。结果显示经PNGaseF处理后,hCREG融合蛋白分子量由30KD降低至25KD,电泳条带下移,证明带有myc和His标签的重组hCREG蛋白为糖基化蛋白。根据6×His与Ni亲合层析的原理用Ni-NTA纯化hCREG重组蛋白。收集的洗脱液经Centriprep离心超滤管（10000NMWL）浓缩后,经BCA法测定并与蛋白标准曲线比较,重组hCREG蛋白浓度为1.6 mg/mL。考马斯亮兰染色可见30KD大小的较单一条带,经image-J软件分析,纯度为92%。浓缩并脱盐后的纯化蛋白经PNGaseF处理后分子量由30KD降至25KD,条带下移,证实纯化后的蛋白仍保留了糖基化形式。流式细胞仪细胞周期分析结果提示重组hCREG蛋白与对照组相比可抑制体外培养的HITASY细胞增殖,G0/G1期细胞比率（共计数2万个细胞）显著增加,且低浓度组的抑制效应要高于高浓度组。BrdU掺入实验结果提示,添加2μg /mL重组hCREG蛋白组与对照组相比可显著抑制体外培养的HITASY细胞增殖,BrdU阳性细胞的比率降低。组间比较有统计学差异（P<0.05）。结论pcDNA 3.1 myc-His/hCREG真核表达载体的构建及具有生物学功能的重组hCREG/myc-His糖蛋白的表达纯化,为hCREG蛋白的功能研究及生物工程制备提供了实验平台。纯化的重组hCREG蛋白可能作为一种新的药物涂于支架表面,通过其促进分化、抑制增殖的生物学功能实现降低支架内再狭窄的作用。
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- [1].E1A基因对三阴乳腺癌细胞侵袭迁移的影响及机制[J]. 山东医药 2017(29)
- [2].E1A激活基因细胞阻遏子蛋白在人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2009(37)
- [3].犬Ⅰ型腺病毒E1A蛋白的生物信息学分析[J]. 特产研究 2020(05)
- [4].腺病毒E1A蛋白、CRP与COPD的相关性研究[J]. 宁夏医科大学学报 2015(03)
- [5].PEI介导的E1A基因对结肠癌细胞放疗增敏效应的研究[J]. 辐射研究与辐射工艺学报 2011(02)
- [6].E1A激活基因阻遏子基因表达与血管外膜成纤维细胞表型转化的关系[J]. 中国介入心脏病学杂志 2014(08)
- [7].聚乙烯亚胺介导的E1A基因对肝癌细胞的化疗增敏效应[J]. 徐州医学院学报 2009(11)
- [8].E1A激活基因阻遏子对抗肿瘤坏死因子α引起的血管内皮细胞炎性损伤[J]. 中国动脉硬化杂志 2011(09)
- [9].E1A激活基因阻遏子蛋白对抗人脐静脉血管内皮细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究 2012(46)
- [10].E1A阻断ras诱导人成纤维细胞衰老机制的研究[J]. 南方医科大学学报 2011(08)
- [11].E1A激活基因阻遏子基因-3600C/T多态性与早发冠心病的关联研究[J]. 中国实用内科杂志 2010(05)
- [12].E1A激活基因阻遏子促进人血管内皮细胞VEGF分泌和单层通透性增加[J]. 中国病理生理杂志 2011(01)
- [13].E1A激活基因阻遏子蛋白过表达可抑制人血管平滑肌细胞的迁移[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2011(37)
- [14].E1A激活基因阻遏子在动脉粥样硬化血管中的表达及其与炎症因子的关系[J]. 心脏杂志 2016(01)
- [15].人E1A激活基因阻遏子-Fc重组蛋白在小鼠肥胖中作用研究[J]. 临床军医杂志 2020(10)
- [16].E1A激活基因阻遏子基因表达变化与颈动脉血管重塑的关系[J]. 生物化学与生物物理进展 2015(02)
- [17].腺病毒E1A蛋白对大鼠肺泡上皮细胞及人肺腺癌细胞凋亡的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2010(05)
- [18].COX-2启动子携带E1A的条件复制性腺病毒(Ad-COX-2-E1A)的构建及鉴定[J]. 中国老年学杂志 2010(24)
- [19].7型腺病毒E1A基因克隆及真核表达[J]. 细胞生物学杂志 2008(02)
- [20].过表达E1A激活基因阻遏子对OxLDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响[J]. 郑州大学学报(医学版) 2019(02)
- [21].E1A激活基因阻遏子蛋白与细胞膜受体IGF2R(11～13)结构域作用抑制人血管平滑肌细胞迁移[J]. 中国动脉硬化杂志 2012(11)
- [22].E1A激活基因阻遏子在动脉粥样硬化血管中的表达变化[J]. 沈阳部队医药 2011(03)
- [23].E1A基因对肝癌细胞放疗增敏作用及其机制探讨[J]. 江苏医药 2010(23)
- [24].E1A激活基因阻遏子(CREG)过表达通过抑制p38/JNK信号分子活化对抗人血管平滑肌细胞凋亡[J]. 生物化学与生物物理进展 2009(12)
- [25].强力霉素调控小鼠E1A激活基因阻遏子表达NIH3T3细胞系的建立[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2008(42)
- [26].E1A基因对鼻咽癌放射敏感性影响动物实验研究[J]. 中华肿瘤防治杂志 2017(20)
- [27].氧化应激对腺病毒E1A蛋白活化NF-κB转录活性的影响及其机制研究[J]. 中国应用生理学杂志 2010(04)
- [28].腺病毒E1A基因对细菌脂多糖所致肺泡上皮细胞MMP-9/TIMP-1失衡的影响[J]. 内科理论与实践 2010(06)
- [29].E1A基因下调人鼻咽癌细胞血管内皮生长因子的表达提高放疗敏感性[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2008(20)
- [30].E1A抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖及其分子机制[J]. 中南大学学报(医学版) 2008(07)