磁化多壁碳纳米管固定脂肪酶拆分α-苯基乙醇的研究

论文摘要

α-苯基乙醇是极其重要的有机合成原料,也是手性化合物的代表,存在两个对映体（R,S）-1-苯基乙醇。目前,酶法拆分α-苯基乙醇得到其手性单体具有广阔的应用前景。因游离酶存在热不稳定性、难以回收利用等缺点受到了极大的限制,因此对酶进行固定化,提高酶的存储稳定性,简化酶催化条件以及提高酶的重复利用率显得尤为重要。载体材料的结构及性能会直接影响到固定化酶的催化活性及操作稳定性,是该技术研究领域的重要研究内容。本文对多壁碳纳米管（MWCNTs）进行纯化、氧化和磁化等功能化改造,保留其纳米材料特性,增加纳米材料的磁响应特性,使之作为固定化载体制得磁化固定化脂肪酶并用于催化拆分α-苯基乙醇的研究,旨在以此为反应模型探讨酶催化拆分手性物质的机理,为碳纳米管在手性药物的拆分应用领域提供新途径。本文在2-（N-吗啉）乙磺酸（MES, pH 6.2）缓冲液中,以N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HC1）为交联剂活化载体材料,在磷酸缓冲液（PBS, PH8.0）中将Candida.sp99-125脂肪酶交联到磁化多壁碳纳米管（Magnetic-MWCNTs）上。经UV、XRD、XPS、Raman spectrum、IR及FTIR、TEM等对载体和固定化酶进行表征。采用BCA法测定磁化固定化酶的最大负载量为1.45mg lipase/mg Magnetic-MWCNTs。根据铜皂法测定固定化酶相对酶活。以乙酸乙烯酯为酰基供体,从多个方面考察了在正庚烷、离子液体、正庚烷-离子液体两相中,酶催化拆分α-苯基乙醇的效果。利用高效液相色谱法来定量分析反应过程底物及产物的变化,以此计算相应的对映体过剩量e.e和底物转化率C。结果表明在正庚烷中,应用磁化固酶,在反应温度为55℃转化率可达50%,e.e.s达到98.5%。游离酶和磁化固酶在正庚烷-离子液体两相体系中的最适反应温度皆为55℃。在50℃-60℃之间时,两相反应体系比单相反应体系效果好。结果还显示,磁化固定化酶抗超声能力强于游离酶,且磁化分离效果好。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 α-苯基乙醇以及对其拆分概述
• 1.1.1 α-苯基乙醇的理化性质
• 1.1.2 α-苯基乙醇的拆分研究现状
• 1.1.2.1 微生物拆分α-苯基乙醇
• 1.1.2.2 酶法拆分α-苯基乙醇
• 1.2 脂肪酶在拆分手性化合物中的应用
• 1.2.1 脂肪酶的概述
• 1.2.2 脂肪酶的催化原理
• 1.2.3 脂肪酶在手性拆分中的应用
• 1.2.3.1 脂肪酶催化不对称酯化反应
• 1.2.3.2 脂肪酶催化不对称转酯化反应
• 1.2.3.3 脂肪酶催化不对称水解反应
• 1.2.4 酶的固定化技术及应用
• 1.2.4. 固定化酶的优点
• 1.2.4.2 固定化酶的载体
• 1.2.4.3 固定化酶的方法
• 1.2.4.4 固定化酶存在的问题
• 1.3 磁性材料的概述
• 1.4 碳纳米管的概述及功能化
• 1.4.1 碳纳米管的研究历程和基本特性
• 1.4.2 碳纳米管的制备简介
• 1.4.3 碳纳米管的功能化
• 1.4.3.1 碳纳米管的纯化
• 1.4.3.2 碳纳米管的氧化
• 1.4.3.3 碳纳米管的磁化
• 1.5 实验表征手法概述
• 1.6 本课题研究的意义和主要内容
• 第二章 实验分析方法的建立
• 2.1 实验仪器及材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拆分实验原理
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 分析方法的建立
• 2.3.1 高效液相色谱分析
• 2.3.2 标准曲线的制作
• 2.3.3 相关拆分参量的数据计算
• 2.4 本章小结
• 第三章 脂肪酶的固定化及表征
• 3.1 实验材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 脂肪酶来源
• 3.1.1.2 试剂
• 3.1.1.3 仪器与设备
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 酶活测定方法
• 3.1.2.2 蛋白含量的测定方法
• 3.1.2.3 碳纳米管的功能化
• 3.1.2.3.1 碳纳米管的纯化
• 3.1.2.3.2 碳纳米管的氧化
• 3.1.2.3.3 碳纳米管的磁化
• 3.2 脂肪酶相关性质的测定及脂肪酶的固定化
• 3.2.1 脂肪酶的最适反应pH值
• 3.2.2 脂肪酶的pH稳定性的测定
• 3.2.3 脂肪酶在水相的最适反应温度的测定
• 3.2.4 脂肪酶的固定化
• 3.3 载体及固定化酶的性能表征
• 3.3.1 交联酶中酶的交联量
• 3.3.2 紫外可见光光谱（UV-vis）检测
• 3.3.3 圆二色性光谱（Circular Dichroic Spectroscopy）检测
• 3.3.4 傅立叶变换红外光谱（FT-IR）检测
• 3.3.5 透射电镜（TEM）及高倍透射电镜（HRTEM）观察
• 3.3.6 X-射线衍射（XRD）检测
• 3.3.7 X射线光电子能谱仪（XPS）检测
• 3.3.8 拉曼光谱（Raman spectra）检测
• 3.3.9 磁性检测
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 脂肪酶的最适反应pH值
• 3.4.2 pH稳定性的考察
• 3.4.3 脂肪酶的最适反应温度
• 3.4.4 紫外可见光谱图分析
• 3.4.5 圆二色性光谱图分析
• 3.4.6 傅立叶变换红外光谱谱图分析
• 3.4.7 透射电镜及高倍透射电镜观察
• 3.4.8 X-射线衍射图谱分析
• 3.4.9 X射线光电子能谱分析
• 3.4.10 拉曼光谱分析
• 3.4.11 磁性检测分析
• 3.5 本章小结
• 第四章 固定化酶拆分外消旋体α-苯基乙醇
• 4.1 实验仪器及试剂
• 4.2 有机相中酶催化拆分消旋体α-苯基乙醇
• 4.2.1 有机溶剂的选择
• 4.2.2 酰基供体的确定
• 4.2.3 温度对拆分反应的影响
• 4.2.4 底物与酰基供体摩尔比的考察
• 4.2.5 拆分反应时间的确定
• 4.2.6 超声时间对脂肪酶催化拆分反应的影响
• 4.3 离子液体中酶催化拆分消旋体α-苯基乙醇的研究
• 4.3.1 离子液体的筛选
• 4.3.2 考察正庚烷-离子液体两相中的酶催化拆分
• 4.3.3 界面反应考察
• 4.4 本章小结
• 第五章 主要结论与建议
• 5.1 主要结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者和导师简介
• 附录