蓝色花形成相关基因cDNA克隆与植物表达载体构建

论文摘要

以蓝色矮牵牛（Petunia hybrida）、风信子（Hyacinthus orientalis）和葡萄风信子（Muscari botryoides）不同时期（花蕾期、初花期、盛花期）的花瓣为材料,利用RT-PCR技术就蓝色花形成相关基因cDNA克隆及植物表达载体构建进行了研究,取得了以下研究结果:1.建立了适合葡萄风信子多糖组织总RNA提取的优化的CTAB法;利用RT-PCR技术从矮牵牛的蓝紫色花瓣中分离了两个控制花色的类黄酮-3’,5’-羟基化酶（F3’5’H）基因HF1（1622bp）和HF2（1677bp）,同时分离了能提高类黄酮-3’,5’-羟基化酶活性的B5蛋白编码基因DifF（464bp）。2.从蓝色风信子花瓣中分别克隆得到了710bp的cDNA片段, Blastx比对结果表明分别与其它物种的类黄酮-3’,5’-羟基化酶（F3’5’H）氨基酸序列同源性较高,达40%-68%,序列相似性分析的结果初步表明分离了风信子F3’5’H cDNA片段（登录号:EF468472）3.构建了含有矮牵牛类黄酮-3’,5’-羟基化酶（F3’5’H）基因HF1的植物表达载体pWR306-HF1。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 花色形成概述
• 1.2 蓝色花的形成
• 1.3 蓝色花色合成途径中相关基因的研究
• 1.3.1 类黄酮-3’5’-羟基化酶作用机理
• 1.3.2 同源类黄酮-3’5’-羟基化酶基因的表达特性
• 1.3.3 类黄酮-3’5’-羟基化酶基因的分离
• 1.3.4 类黄酮-3’5’-羟基化酶基因的应用研究
• 1.4 植物基因克隆的几种常用方法
• 1.4.1 根据已知序列或其它物种中已有序列克隆基因
• 1.4.2 表型基因克隆法
• 1.4.3 转座子标签技术
• 1.4.4 mRNA 差异表达显示法
• 1.4.5 植物功能基因的克隆
• 1.4.6 DNA 芯片技术
• 1.4.7 图位克隆技术
• 1.4.8 利用生物信息学进行的电子克隆
• 1.5 利用基因工程技术培育蓝色花卉的策略
• 1.6 本研究的目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 感受态细胞
• 2.1.6 质粒
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 RNA 的提取
• 2.2.2 反转录PCR 扩增
• 2.2.3 PCR 产物回收
• 2.2.4 连接反应
• 2.2.5 转化大肠杆菌及筛选
• 2.2.6 酶切鉴定
• 2.2.7 菌液保存及cDNA 片段测序
• 第三章 结果与分析
• 3.1 RNA 的提取
• 3.1.1 葡萄风信子RNA 的提取
• 3.1.2 矮牵牛和风信子总RNA 的提取
• 3.2 对三种植物材料总RNA 进行反转录PCR
• 3.3 PCR 产物的回收克隆及酶切鉴定
• 3.4 克隆CDNA 片断序列分析
• 3.4.1 矮牵牛类黄酮-3’5’-羟基化酶基因（HF1、HF2）克隆序列分析
• 3.4.2 矮牵牛85 蛋白编码基因（DifF）克隆序列分析
• 3.4.3 风信子类黄酮-3’5’-羟基化酶基因（F3’5’H）克隆序列分析
• 3.5 矮牵牛类黄酮-3’5’-羟基化酶基因HF1 的表达载体构建
• 第四章 讨论
• 4.1 关于本研究中RNA 分离提取的技术
• 4.1.1 基础方法的选择
• 4.1.2 多糖的处理
• 4.2 关于本研究中植物材料的选择与CDNA 片段的克隆
• 4.2.1 本研究植物材料的选择
• 4.2.2 本研究cDNA 片段的克隆
• 4.3 关于本研究中表达载体的构建
• 4.3.1 目标cDNA 片段与表达载体的重组
• 4.3.2 菌落直接PCR 鉴定筛选重组子
• 4.3.3 中间表达载体的选择
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介