漠斑牙鲆性分化及性别控制技术的初步研究

论文摘要

漠斑牙鲆（Paralichthys Lethostigma）,是一种具有较高营养价值和商业捕捞价值的优良鱼种,其饵料转化率高,养殖成本低,是进行人工增养殖的名优品种。本论文以工厂化养殖漠斑牙鲆为研究对象,以组织切片法为监测手段,对养殖漠斑牙鲆性腺分化、温度和激素诱导性逆转、人工雌核发育等方面进行了初步研究和探讨,所得结果如下:1.漠斑牙鲆性腺分化的组织学观察本试验采用组织学和形态学观察手段,对0日龄初孵仔鱼270日龄漠斑牙鲆成鱼的性腺分化和发育情况进行跟踪观察,以期补充和完善漠斑牙鲆性腺发育的有关资料,为单性苗种的制种和培育提供技术参考。结果表明:在水温20±0.5℃条件下,漠斑牙鲆孵化后10日龄,全长4.0±0.36mm时,PGCs呈椭圆形,体积大,核大,核膜明显,刚出现生殖嵴;35日龄,全长16.9±0.84mm时,PGCs细胞聚集,从体壁游离出来,进入腹腔后部,此时生殖嵴的大小开始分化,大的生殖嵴迅速增大,生殖细胞开始有丝分裂,生殖细胞数目迅速增多,逐渐形成了原始性腺。85日龄,全长5.9±0.32cm,部分性腺中开始出现生殖细胞的有丝分裂,形成成簇发育的PGCs群,其中少数发育成为卵母细胞,标志着性腺形态学分化的开始。120日龄,全长8.3±0.81cm,漠斑牙鲆卵巢的上下两缘不断延伸,形成分化的两支,开始形成卵巢腔,同时形成数个生殖板。180日龄,全长13.4±1.2 cm时,卵巢分化完成。漠斑牙鲆精巢分化晚于卵巢,130日龄,全长为6.3±0.52cm时,原始性腺中精原细胞有丝分裂开始,性腺体积增大,生殖上皮细胞明显;160日龄,全长为6.8±0.56cm时,精小管原基出现,标志着精巢分化开始;200日龄,全长为8.7±0.93 cm时,精小叶和输精管等结构出现,输精管的出现标志着精巢分化的完成;240日龄,全长为10.3±1.1cm时,精巢中精小叶,精母细胞,精小管等结构明显,漠斑牙鲆雄鱼进入成熟发育期。漠斑牙鲆由原始性腺逐渐发育分化为不同结构和功能的卵巢或精巢,在无外界因素干扰下,分化后的分化类型稳定不变,此种性腺分化类型的漠斑牙鲆属于雌雄异体的分化型鱼类。2.真鲷冷冻精子诱导漠斑牙鲆减数雌核发育研究本文采用紫外线（UV）灭活的冷冻真鲷精子激活漠斑牙鲆卵子发育,冷休克法抑制第二极体排出,成功获得雌核发育杂合二倍体仔鱼。试验结果显示:冷冻真鲷精子适宜的UV灭活剂量为72mJ/cm2,随着处理时间（0100s）延长,已灭活精子受精后的胚胎孵化率呈哈特维希效应,40s灭活组胚胎孵化率达到最高29±1.9%,单倍体率100%。冷休克处理温度02℃,起始时刻3min、持续时间45min时,胚胎的二倍体孵化率最高9.4±0.71%。雌核发育后代经流式细胞仪、形态学观察和染色体倍性鉴定,均为二倍体（2n=48）,未发现单倍体和非整倍体现象。胚胎发育时序跟踪观察表明冷休克组和单倍体组发育同比正常孵化组时间（49h45min）差异显著,分别历时64h59min和55h49min。雌核发育二倍体与正常仔鱼数量形状差异不显著（P>0.05）,但单倍体仔鱼明显畸形,与正常组和雌核组仔鱼在上述指标上存在显著差异（P<0.05）。3.环境因子对漠斑牙鲆性腺分化的影响在漠斑牙鲆孵化后40160日龄期间,以17α-甲基睾酮（17α-MT）和17β-雌二醇（17β-Estradiol）为诱导因子,分别设置20、60、80、100μg/L 4种浓度梯度,采用浸泡法处理实验样本,160日龄后转入正常水体养殖至200日龄,每组分别取样以石蜡组织切片法鉴定表型性别,结果显示:60μg/L、80μg/L、100μg/L的MT浸浴处理都能显著提高群体中的雄性比例,分别达到78.5%（P<0.05）、83.4%（P<0.05）、87.3%（P<0.05）。17β-Estradiol各试验组雌性化比例差异不明显,雌性比例分别为58.2%、66.8%、71.3%、71.8%。同批漠斑牙鲆孵化后每组随机选取120尾进行温度诱导研究,分别精确控温至14℃,18℃,22℃（正常对照组）,26℃,32℃温度培养至160日龄,转到21-23℃正常水温养殖至200d,石蜡组织切片鉴定性别,结果表明:26℃和32℃高温能明显提高群体中的雄性比例,使其分别达到66.3%（0.01<P<0.05）和72.5%（0.01<P<0.05）;而低温14℃和18℃也使仔鱼群体中雄性比例分别达到63.8%（P>0.05）和58.8%（P>0.05）;对照组群体中雌雄个体比例接近1:1。温度能促使漠斑牙鲆原始性腺向雄性方向分化,因此该鱼属于温度依赖型性别决定类型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1. 鱼类性别决定类型及机制
• 1.1 染色体决定模式
• 1.2 多基因决定模式
• 1.3 基因型-环境共同决定模式
• 2. 鱼类性别控制方法
• 2.1 环境因子调控
• 2.2 外源激素诱导
• 2.3 雌（雄）核发育技术
• 3. 鱼类性腺分化的研究进展
• 3.1 鱼类性腺分化时间
• 3.2 鱼类性腺分化标志
• 3.3 鱼类性腺分化的类型
• 4. 研究目的、意义和展望
• 4.1 研究的目的
• 4.2 研究意义
• 4.3 研究展望
• 第二章 漠斑牙鲆性分化的组织学观察
• 1 材料和方法
• 1.1 样本培育
• 1.2 样品采集
• 1.3 石蜡切片样品制备
• 1.4 样本生物学指标测定
• 2. 结果
• 2.1 漠斑牙鲆原始性腺的发育（见图版1）
• 2.2 漠斑牙鲆卵巢的分化（见图版2）
• 2.3 漠斑牙鲆精巢的分化（见图版3）
• 3 讨论
• 3.1 漠斑牙鲆的性腺分化类型
• 3.2 漠斑牙鲆原始性腺的发生
• 3.3 漠斑牙鲆卵巢的分化
• 3.4 漠斑牙鲆精巢的分化
• 4 小结
• 4.1 卵巢分化时间
• 4.2 卵巢分化标志
• 4.3 精巢分化时间
• 4.4 精巢分化标志
• 4.5 性腺分化类型
• 第三章 真鲷冷冻精子诱导漠斑牙鲆减数雌核发育研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 亲鱼催产
• 1.2 真鲷精子灭活剂量刷选
• 1.3 冷休克诱导二倍体雌核发育
• 1.4 倍性检测
• 1.5 胚胎发育时序观察
• 1.6 数据分析
• 2. 结果
• 2.1 真鲷冷冻精子UV 灭活
• 2.2 冷休克诱导雌核发育二倍体发育
• 2.3 倍性检测
• 2.4 漠斑牙鲆单倍体、雌核发育二倍体及正常胚胎组发育时序
• 2.5 实验组初孵仔鱼受精率、孵化率和畸形率统计
• 3. 讨论
• 3.1 诱导条件
• 3.2 胚胎发育
• 4. 小结
• 4.1 真鲷冷冻精子UV 灭活剂量
• 4.2 冷休克法诱导雌核发育二倍体发育条件
• 4.3 漠斑牙鲆单倍体、雌核发育二倍体及正常胚胎组发育差异
• 第四章 温度和激素对漠斑牙鲆性腺分化的影响
• 1. 材料与方法
• 1.1 样本培育
• 1.2 试验方法
• 1.3 样品采集
• 1.4 石蜡切片样品制备
• 1.5 数据处理
• 2 试验结果
• 2.1 性逆转中漠斑牙鲆性腺发育情况
• 2.2 性逆转中漠斑牙鲆生长性状差异
• 2.3 性逆转中漠斑牙鲆成活率及性转化率
• 3 讨论
• 4 小结
• 4.1 温度诱导漠斑牙鲆性逆转参数
• 4.2 激素诱导漠斑牙鲆性逆转参数
• 4.3 环境诱导对漠斑牙鲆性腺分化的影响
• 参考文献
• 附录
• 致谢