志贺菌主动外排泵AcrAB-TolC的基因调控研究

论文摘要

志贺菌属细菌（简称志贺菌）是细菌性痢疾的病原体,细菌性痢疾至今仍是影响人类健康的主要肠道传染病之一,20世纪60年代以来志贺菌对四环素等多种传统抗生素普遍耐药,80年代以来,喹诺酮类药物,尤其是氟喹诺酮类药物,因其抗菌谱广,独特的作用机制,优秀的药物动力学特征和良好的抗菌活性,成为临床治疗菌痢的一类药物,然而,随着该类药的广泛应用及滥用,致使细菌耐药性迅速增加,耐药性产生的直接后果是严重影响了临床疗效,增加了治疗成本,同时缩短了新药的应用周期,增大了新药的研究与开发成本。因此,深入研究抗生素的耐药机制,进而探索解决其耐药性的方法,开发新型抗菌药物,以遏制或减缓细菌性痢疾耐药的发展已迫在眉睫。近年来的研究表明,在一些细菌中存在主动外排现象,即细菌能将扩散进细胞内的多种结构不相关的抗菌药物主动泵出细胞外,从而使细菌获得耐药性。研究较多的是大肠埃希氏菌AcrAB-TolC主动外排泵。其耐药机制是由染色体介导的在一个调节位点控制下的多基因协作表型,其染色体上相关位点的突变可导致细菌主动外排泵蛋白表达增加,从而将结构不同的药物泵出细胞膜外,致细胞内药物达不到有效浓度,即产生多重耐药。AcrAB-TolC系统受多种调节因子的调节,常见的为AcrR抑制子与MarRAB操纵子。有研究报道AcrR抑制子对acrAB转录起一定程度的抑制作用;marRAB操纵子结构包括:①启动子marO;②阻遏基因marR;③编码不连续的阳性转录调节子marA;④marB。已有研究发现,marO或marR突变时,marRAB的转录去阻遏,致MarA超表达,从而激活AcrAB-TolC系统,产生多重耐药现象。但研究也发现may突变虽然集中发生在marOR区域内,并未发现一个突变热点区,在此区域内任何位置的突变,似乎均可降低细菌对抗生素的敏感性,并且同其他耐药突变相似,多个位点突变的积累和较大基因片断的缺失会导致细菌高度耐药。已有研究证实AcrAB-TolC主动外排泵在志贺菌中也存在,本课题组在前期工作中已扩增出志贺菌主动外排泵结构基因acrAB-tolC,并发现多重耐药株acrA mRNA水平显著高于敏感株。然而,在acrAB-tolC基因突变株与未突变株中,其mRNA表达水平差异无统计学意义。提示acrAB-tolC基因本身突变不影响其表达改变,可能是受MarRAB操纵子、AcrR抑制子等调控的结果。鉴于此,本研究对志贺菌主动外排泵的调控基因进行了研究,以了解主动外排泵上游调控基因在志贺菌多重耐药机制中所起的作用,并期望能在多重耐药株主动外排泵调控基因上发现与多重耐药关系密切的共有突变区。我们对临床收集的志贺菌进行有机溶剂耐受试验检测主动外排泵AcrAB-TolC的表达状况,PCR扩增AcrAB-TolC的调控基因acrR、marOR,运用SSCP技术对其突变性进行检测,利用核酸测序技术分析其具体的突变情况。方法1.菌株鉴定:对保存菌株在LB平板上划线复苏并重新进行生化及血清学鉴定,以保证菌株的可靠性。2.多重耐药株和敏感株的筛选:药物敏感试验采用Kinby-Bauer纸片琼脂扩散法,按照美国国立临床实验室标准委员会（NCCLS）制定的指南进行。对实验室收集的54株志贺菌进行四环素、氯霉素、氨苄青霉素、环丙沙星、诺氟沙星等药物的药敏试验,以对2种或以上不同类抗菌药物耐药者即可称为多重耐药株（Mar）,对5种抗菌药物均敏感的为敏感株,余者为单耐药株。3.有机溶剂耐受试验（Organic solvent tolerance,OST）:待志贺菌增菌至对数中期,PBS缓冲液稀释至106～107cells/ml,取5ul置于LB固体培养基上,待晾干后覆盖上正己烷、环己烷或二者的混合物（体积比,3:1,1:1,1:3）,厚度约2～3mm,将固体培养基置于密封容器中,30℃孵育24～36h,若斑点出现融合生长,则为有机溶剂耐受,重复3次。4.志贺菌acrR、marOR基因的单链构象多态性（PCR-SSCP）分析:煮沸法提取模板DNA,PCR扩增acrR、marOR基因,扩增产物采用TaqI限制性内切酶酶切,酶切产物变性后进行8%聚丙烯酸胺凝胶电泳,硝酸银染色后观察结果并照相,根据单链带数目和位置判断有无基因突变。5.对志贺菌acrR、marOR基因突变菌株PCR产物进行核酸序列分析。结果1.菌株鉴定:共复苏鉴定临床分离志贺菌54株,其中福氏志贺菌41株,宋内志贺菌10株、痢疾志贺菌3株。2.多重耐药株和敏感株的筛选:根据54株志贺菌对四环素、氯霉素、氨苄青霉素、环丙沙星、诺氟沙星等药物的药敏试验结果,筛选出多重耐药株35株,单耐药株8株,敏感株11株。多重耐药率为64.8%。3.志贺菌对有机溶剂的耐受试验:54株志贺菌中有38株对有机溶剂耐受,总耐受率为70.37%,其中33株为多重耐药株,3株为单耐药株,仅有2株为敏感株。多重耐药株组对有机溶剂的耐受率为94.29%,显著高于志贺菌非多重耐药株组（26.32%）,差异有显著性（P＜0.05）。4.acrR、marOR基因PCR扩增结果:35株多重耐药株、8株单耐药株和11株敏感株及志贺菌参考株全部扩增出acrR、marOR基因片段,分别为564bp和604bp,未发现这2个基因的缺失。5.acrR、marOR基因SSCP分析结果:（1）acrR基因:全部多重耐药株、单耐药株、敏感株和参考株具有一致的单链构象,未发现突变菌株。（2）marOR基因:在多重耐药株中,有5株marOR基因存在突变,突变率为14.29%;在单耐药株、敏感株和参考株中未发现突变。6.acrR、marOR基因PCR产物的核酸序列分析:（1）acrR基因:测序的3株多重耐药株acrR基因序列与敏感株和参考株一致,未发现突变。（2）marOR基因:与敏感株Z10和参考株S51250比较,5株突变的志贺菌多重耐药株（H6、H12、N10、N13、198）在marO区1376-1379处均存在4个碱基（CATT）缺失,且有3株还存在2处点突变。结论1.志贺菌的多重耐药率较高,且多重耐药株对有机溶剂的耐受率远高于其他菌株。2.在志贺菌中扩增出acrR、marOR,未发现该二基因缺失株,证实类似大肠埃希菌的主动外排系统AcrAB-TolC的调控基因acrR、marOR广泛分布于志贺菌中。3.研究发现acrR基因序列在志贺菌多重耐药株、单耐药株、敏感株和参考株中一致,未发现突变。4.首次发现,marOR基因第1376-1379处4个碱基的缺失,只存在于志贺菌多重耐药株中而不存在于敏感株和参考株中,推测可能与志贺菌多重耐药有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录1 志贺菌属细菌背景资料表
• 附录2 acrR基因PCR产物测序图
• 附录3 marOR基因PCR产物测序图
• 附录4 图表索引
• 综述部分
• 大肠埃希氏菌药物主动外排泵AcrAB-To1C系统的研究进展
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 硕士研究生期间发表论文
• 后记