论文摘要
0前言营养不良性大疱性表皮松解症（Dystrophic Epidermolysis Bullosa,DEB）是一类由人体VII类蛋白基因（Type VII Collagen,C7）突变或缺失引起的机械性大疱性疾病。其特征是易受损的皮肤,真表皮脱离甚至剥落导致水疱的形成,从而留下瘢痕。不仅如此,病人常常会因为皮肤的反复溃烂而导致四肢的残缺,还会因为口腔粘膜和食道的溃烂导致进食饮水的困难。由此,长期的皮肤及粘膜反复溃烂结疤会发展成恶性鳞状上皮细胞癌。多数患者在年幼时因为该疾病而早夭。DEB分为营养不良性大疱性表皮松解症亚型（DDEB）和隐性营养不良性大疱性表皮松解症亚型（RDEB）两种。DEB已给数以千计的家庭带来痛苦。在这些病人中有超过三百种不同的C7变异亚型。C7基因的突变导致了锚原纤维合成和装配的异常,以及真表皮之间的黏附。最严重的DEB亚型为隐性DEB（the Hallopeau-Siemens型, HS-RDEB）,其C7及锚原纤维均缺失。所以,HS-RDEB表征为严重的皮肤水疱,极易受损的皮肤,多层瘢痕引起的手足残缺、关节挛缩和食道狭窄。HS-RDEB病人在其二十至四十岁期间由于长期性的皮肤创伤会引发侵袭性鳞状细胞癌而导致癌细胞的转移乃致死亡。C7是锚原纤维的主要成分,而锚原纤维则是皮肤基底膜带用来“连接”真皮与表皮的附属结构。C7基因由三条相同的α链组成,每条α链都包括了一个大小为145 kDa,重复编码为Gly-X-Y的胶原性氨基酸三螺旋结构,一个145 kDa的非胶原性片断位于氨基端（NC1）,羧基端也是一个非胶原性片断,不过大小只有34 kDa（NC2）。NC1基端被公认为可作用于BMZ的一端,并且也是IV胶原蛋白的氨基终端。本实验运用具有免疫活性的不表达COL7A1基因敲除小鼠模型（其临床症状类似于人类RDEB患者）,采用分子生物学和免疫学等实验研究技术,探讨和研究了C7蛋白基因对遗传性RDEB的治疗作用,为C7蛋白基因药物的进一步研发奠定基础。1研究目的研究重组人C7基因的体内、外表达;为DEB的治疗提供临床前研究实验依据。2实验方法2.1重组C7外表达的修复2.1.1细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F12（1:1）培养基中,永生化培养RDEB成纤维细胞（原代RDEB成纤维细胞来自于斯坦福大学的S. Herron）,培养箱温度为37°C,及5% CO2。2.1.2慢病毒载体的基因转染将全长8850bp的C7基因亚克隆进入慢病毒转染载体SMPU的聚合接点序列,且恰好位于内部启动子MND的下游,然后将构建好的携带有C7的病毒转染入RDEB成纤维细胞。2.1.3免疫荧光染色以免疫荧光染色法检验RDEB成纤维细胞的转染质量。2.1.4 C7的纯化及分析免疫印迹实验中,经转染的RDEB成纤维细胞长到汇合,加入含150μM的抗坏血酸条件培养液中生长24小时。收集培养液,加入丝氨酸蛋白酶抑制剂,用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳法定量定性。Western印迹测试中,我们用C7的NC1域作为多克隆抗体由而探测到C7的存在。在大量纯化重组C7中,含有丝氨酸蛋白酶抑制剂和硫酸铵的无血清培养液搅拌过夜,透析,然后离心使不溶物质沉淀,再将沉淀物重新溶解,过Q-琼脂糖（Amersham Biosciences,Inc.）,NaCl线性梯度洗脱,最终C7保存于1M-NaCl中。2.2重组C7体内表达的修复2.2.1 C7显性缺失小鼠的鉴别C7显性缺失小鼠（C57B/L系列）也被称为DEB小鼠,在其出生之后即可从爪部和/或腹部的红色水泡辨别其特征。2.2.2 C7隐性缺失小鼠的鉴别C7隐性缺失小鼠必须采用聚合酶链反应（PCR）才能确认其基因型。2.2.3 C7对C7显性缺失小鼠的治疗每日在DEB小鼠的背部皮下注射一定量的COL7A1（C7）,根据小鼠存活时间（4天至7个月不等）,累计注射到每只DEB小鼠的C7量从20μg to 300μg不等。2.2.4皮肤组织的免疫荧光染色及超微结构分析嵌入OCT中的组织在低温保持器中切成5μm厚,以丙酮固定,然后用能识别小鼠C7及人C7的兔多克隆抗体进行培育,再用掺有CY3的羊抗兔IgG抗体结合。样本用40%的甘油隔绝空气之后,Zeiss Axioplan荧光显微镜和Zeiss Axiocam MRM数码相机完成检测及拍摄。2.2.5重组NC1的酶联免疫吸附试验（ELISA）体循环中产生的抗C7抗体用ELISA法测定。不同时间点从6只注射了C7的DEB小鼠提取血清,以NCL作参比对照,分析抗C7抗体的浓度。2.2.6治疗组MR1和对照组IgG比较3只DEB小鼠腹腔注射MR1,其对照组的3只DEB小鼠注射仓鼠Ig G。基于之前的报道,我们展开了MR1的剂量反应研究。首日2×10-2μg/kg,第2,4,7,14,21,28天剂量依次为1×10-2μg/kg。每月收集一次血清样本,ELISA法定量。3实验结果3.1重组VII胶原蛋白体外表达的修复3.1.1运用慢病毒载体进行基因转染全长8850bp的C7基因被亚克隆进慢病毒转染载体SMPU的聚合接点序列,且恰好位于内部启动子MND的下游。经转染的RDEB成纤维细胞也携带C7的cDNA。3.1.2免疫荧光染色细胞95%呈阳性结果,荧光显微镜下检测,之后拍照。3.1.3 C7的纯化及分析Western印迹法和coomassie蓝染色法定性和定量及纯化C7。3.2重组C7体内表达的修复3.2.1 C7显性缺失小鼠的鉴别采用C7治疗。3.2.2 C7隐性缺失小鼠的鉴别C7隐性缺失小鼠被用来繁殖。3.2.3 C7对C7显性缺失小鼠的治疗C7注射两到三次后,小鼠水疱症状减轻,并无新水疱形成。3.2.4皮肤组织的免疫荧光染色及超微结构分析经染色的基底膜带可观测到阳性反应,锚原纤维结构得到矫正以及重新形成,由此可以证明DEB小鼠皮肤组织中主要的超微结构异常得到矫正。3.2.5重组NC1的ELISA最初注射的三十天内,6只DEB小鼠血清样本全含有抗C7抗体,而且其含量随时间的延长而增加。3.2.6治疗组和对照组IgG比较对照组小鼠全部产生抗C7 IgG,抗体也持续存在。相反地是,治疗组小鼠在任何时间点均未测出抗C7 IgG。4结论重组并体外表达的C7可改善甚至逆转RDEB模型小鼠的DEB症状。
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