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TRAIL对耐药相关基因SIRT1作用效应的研究

2020-12-16阅读(846)

TRAIL对耐药相关基因SIRT1作用效应的研究

论文摘要

食管癌（esophageal carcinoma）是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤,占所有恶性肿瘤的2%,我国是世界上食管癌高发地区,平均每年病死约15万人,手术后化疗是治疗食管癌的重要方法之一。近些年,由于药物的不规范使用、肿瘤细胞基因的不稳定性、表达异质性、高突变率以及个体对化疗方案的敏感性差异等原因,导致患者预后很差,肿瘤产生耐药性是术后肿瘤病人化疗失败及复发的主要原因之一,因此,降低肿瘤细胞耐药性成为临床治疗亟待解决的重要问题。沉默信息调节因子1（silent information regulator type 1, SIRT1）是人类的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs）,基因位于10q22.1,长约33 kb,翻译后的蛋白质分子量大小约为60 KD,具有NAD依赖的去乙酰基酶活性。它在DNA损伤修复、细胞周期控制、抑制细胞凋亡、抵抗氧化逆境和延长细胞寿命方面起着重要作用,因此SIRT1被称为“长寿基因”。研究表明5种临床肿瘤的活检标本和不同细胞来源的耐药细胞,均发现SIRTl的高水平表达,能直接诱导多药耐药基因的表达。肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（Tumor necrosis factor（TNF） -related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）是通过与FasL和TNF有较高的序列同源性被发现的,又被称为Apo2L,定位在人类3号染色体3q26上,全长大约有1769bp,分子量大概为32.5KD,它编码281个氨基酸序列。TRAIL因其能够有效地抑制并杀死肿瘤细胞但对正常细胞的凋亡作用较小而引起人们的普遍关注。有研究显示,TRAIL还可与化、放疗协同发挥作用,从而达到逆转肿瘤耐受、多要耐药的目的。但国内关于TRAIL与耐药基因SIRT1作用关系的研究很少,尚未见报道。本课题研究采用构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-TRAIL的方法,用脂质体转染食管癌细胞来进一步研究TRAIL在食管癌细胞中的表达及其产生的凋亡效应,并初步探讨TRAIL对肿瘤耐药相关基因SIRT1的作用效应,为降低肿瘤耐药性研究奠定理论基础。目的：构建真核表达载体pcDNA3.1 （+）-TRAIL,检测其在食管癌细胞中的表达及产生的凋亡作用,并初步探讨TRAIL对肿瘤耐药相关基因SIRT1的作用效应,为逆转肿瘤细胞的多药耐药性提供实验基础。方法：用HindⅢ和BamHⅠ双酶切的方法从原核载体pCA13-TRAIL上切下目的基因TRAIL,回收大约848bp大小片段,并同时双酶切真核表达载体pcDNA3.1（+）,然后用T4连接酶进行连接,构建重组真核表达载体pcDNA3.1 （+）-TRAIL并用双酶切进行鉴定；用脂质体2000将重组质粒转染到人食管癌细胞EC9706中,48h以后用RT-PCR和免疫细胞化学方法分别检测其在食管癌细胞中mRNA和蛋白水平的表达；光学显微镜和倒置相差显微镜观察细胞凋亡过程的一般生物学形态变化；用流式细胞技术检测转染重组质粒24h、48h后对食管癌细胞产生的凋亡效应；RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测重组质粒TRAIL对耐药相关基因SIRT1的mRNA和蛋白表达水平的影响,初步探讨TRAIL对肿瘤耐药相关基因SIRT1的作用效应。结果：1重组真核表达载体pcDNA3.1（+）-TRAIL的构建及鉴定用HindⅢ和BamHⅠ双酶切pCA13-TRAIL质粒,回收约848bp大小片段,将此片段与同时双酶切后的pcDNA3.1（+）用T4连接酶连接,构建重组质粒；经双酶切鉴定后得到的片段大小分别为5400bp左右和800bp左右,说明TRAIL基因成功地克隆到表达载体pcDNA3.1（+）中。2重组质粒TRAIL基因在食管癌细胞中表达的鉴定重组质粒用脂质体瞬时转染食管癌细胞,48h后,提取细胞RNA, RT-PCR结果显示转染pcDNA3.1（+）-TRAIL组较未转染组、转染pcDNA3.1（+）空质粒组表达量显著增高,电泳结果经软件检测未转染组、转染空质粒组和转染组灰度值与相应内参的比值分别是1.05±0.33、1.05±0.33和1.80±0.35,说明转染目的基因组TRAIL基因的mRNA表达显著增强（P<0.05）；转染48h后,用免疫细胞化学方法检测显示TRAIL在细胞膜、质均有表达且转染目的基因组的棕黄色明显高于未转染组,经软件检测得到的灰度值分别为118.23±0.46和78.19±0.41,说明转染后TRAIL基因蛋白水平的表达显著增高（P<0.05）。3 TRAIL对食管癌细胞的凋亡作用流式细胞术结果显示：转染重组质粒24h未见凋亡曲线,而48h后细胞周期有凋亡曲线,较未转染组增殖指数减少明显（P<0.05）,说明转染后48h TRAIL基因的凋亡作用达高峰。4重组质粒对肿瘤耐药相关基因SIRT1的作用效应重组质粒用脂质体瞬时转染食管癌细胞,48h后,提取细胞RNA, RT-PCR显示转染pcDNA3.1（+）-TRAIL组较、未转染组、转染pcDNA3.1（+）空质粒组表达量显著降低,电泳结果经软件检测未转染组、转染空质粒组和转染组灰度值与相应内参的比值分别是1.79±0.35、1.79±0.35和1.06±0.32,说明转染后对耐药基因SIRT1的mRNA表达显著抑制（P<0.05）；转染48h后,用免疫细胞化学方法检测显示SIRT1在细胞核、质表达显著降低几乎不见棕黄色颗粒,明显低于未转染组,经软件检测得到的灰度值分别为78.18±0.42和118.24±0.46,说明TRAIL能显著抑制耐药相关基因SIRT1蛋白水平的表达（P<0.05）。结论：1本实验成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1 （+）-TRAIL,并证实其能在人食管癌EC9706细胞中的mRNA和蛋白水平大量表达TRAIL基因。2本实验证实了TRAIL基因能对人食管癌EC9706细胞产生凋亡效应。3本实验证实了重组真核表达载体pcDNA3.1 （+）-TRAIL中的TRAIL基因,能抑制肿瘤耐药相关基因SIRT1在mRNA和蛋白水平的表达,为进一步研究TRAIL通过SIRT1基因调节肿瘤耐药机制奠定了实验基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 论文正文
  • 1 前言
  • 2 材料、试剂与仪器
  • 2.1 质粒、菌株和细胞
  • 2.2 引物设计
  • 2.3 主要试剂
  • 2.4 仪器设备
  • 2.5 常用试剂的配制
  • 3 实验方法
  • 3.1 从PCA13-TRAIL上切下目的基因TRAIL
  • 3.1.1 感受态细菌的制备
  • 3.1.2 转化
  • 3.1.3 质粒的提取和酶切鉴定
  • 3.2 真核表达载体PCDNA3.1（+）-TRAIL的构建
  • 3.2.1 载体PCDNA3.1（+）的酶切及片段回收
  • 3.2.2 连接反应
  • 3.2.3 连接反应产物的转化
  • 3.2.4 酶切鉴定
  • 3.3 PCDNA3.1（+）-TRAIL在食管癌细胞EC9706中的表达
  • 3.3.1 食管癌细胞EC9706的培养
  • 3.3.2 细胞的转染
  • 3.3.3 转染后细胞形态学观察
  • 3.3.4 RT-PCR方法鉴定PCDNA3.1（+）-TRAIL在食管癌细胞ECA9706中MRNA水平的表达
  • 3.3.5 免疫细胞化学方法鉴定PCDNA3.1（+）-TRAIL在食管癌细胞EC9706中蛋白水平的表达
  • 3.4 TRAIL对食管癌细胞EC9706产生的凋亡效应
  • 3.4.1 食管癌细胞EC9706的培养
  • 3.4.2 细胞的转染
  • 3.4.3 流式细胞技术检测细胞EC9706凋亡效率
  • 3.5 重组质粒TRAIL对耐药相关基因SIRT1产生的作用效应
  • 3.5.1 RT-PCR方法检测重组质粒TRAIL对SIRT1 MRNA表达水平的影响
  • 3.5.2 免疫细胞化学方法检测重组质粒TRAIL对SIRT1蛋白表达水平的影响
  • 3.6 统计学方法分析数据
  • 4 实验结果
  • 4.1 原核质粒PCA13-TRAIL的鉴定
  • 4.2 真核表达载体PCDNA3.1（+）-TRAIL的构建
  • 4.3 重组真核表达载体PCDNA3.1（+）-TRAIL在食管癌细胞EC9706中的表达
  • 4.3.1 RT-PCR方法鉴定重组真核表达载体PCDNA3.1（+）-TRAIL在食管癌细胞中MRNA水平表达的结果
  • 4.3.2 免疫细胞化学方法鉴定重组真核表达载体PCDNA3.1（+）-TRAIL在食管癌细胞中蛋白水平表达的结果
  • 4.4 重组质粒PCDNA3.1（+）TRAIL对食管癌细胞EC9706产生的凋亡效应
  • 4.5 重组质粒PCDNA3.1（+）-TRAIL对耐药相关基因SIRT1产生的作用效应
  • 4.5.1 RT-PCR方法鉴定重组真核表达载体PCDNA3.1（+）-TRAIL对耐药相关基因SIRT1的MRNA表达水平作用效应的结果
  • 4.5.2 免疫细胞化学方法鉴定重组真核表达载体PCDNA3.1（+）-TRAIL对耐药相关基因SIRT1的蛋白表达水平作用效应的结果
  • 5 讨论
  • 6 结论
  • 参考文献
  • 第二章 综述
  • 第一部分:TRAIL及其与肿瘤关系的研究进展
  • 参考文献
  • 第二部分:SIRT1及其与肿瘤关系的研究进展
  • 参考文献
  • 第三章 附录
  • 英文缩写词
  • 个人简历
  • 致谢

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