论文摘要
鱼藤酮是一种应用广泛的农业杀虫剂,能选择性地结合并抑制线粒体复合物Ⅰ,从而破坏细胞呼吸链的正常功能。流行病学资料显示,长期低剂量接触鱼藤酮的人群帕金森病的发病机率高于未暴露人群。动物实验进一步证实,鱼藤酮能作用于黑质-纹状体多巴胺能神经元,使之发生凋亡。海马组织的胆碱能神经元与黑质纹状体的多巴胺能神经元间联系密切,而MAPK/ERK信号传导通路在学习记忆的形成巩固及神经元凋亡的发生发展中发挥着一定的作用。因此,研究鱼藤酮对海马MAPK/ERK级联的调控机制以及活化后的ERK1/2在神经元凋亡中的具体作用,对于我们从新的角度了解环境因素在神经退行性疾病中的作用机理以及鱼藤酮致细胞凋亡的具体作用途径提供相关的理论依据。目的:通过体内外实验阐明鱼藤酮对大鼠海马MAPK/ERK信号传导通路的上游调控机制,初步判断MAPK/ERK级联在鱼藤酮致海马神经元凋亡中的作用机理,了解环境毒物的具体作用靶点,从而为神经退变性疾病的研究提供理论依据。方法:（1）建立大鼠鱼藤酮染毒模型,观察大鼠一般情况变化,HE染色检测心、肝、脾、肾的改变,以了解鱼藤酮对动物的一般损伤情况。（2）采用HE染色、FJB复合尼氏荧光染色、[Ca2+]i检测、免疫组化、Western蛋白印迹法等多种实验技术,观察鱼藤酮作用对大鼠海马神经元凋亡的影响以及ERK1/2活化情况,检测ERK1/2主要上游调控蛋白因子表达情况。（3）建立原代培养大鼠海马神经元鱼藤酮染毒模型,倒置显微镜观察鱼藤酮体外作用对神经元的影响;MTT法检测细胞活性改变;Annexin-Ⅴ-FITC/PI双标法检测细胞凋亡情况;激光共聚焦显微镜检测神经元[Ca2+]i变化;通过加入MEK抑制剂PD98059、L型Ca2+通道阻断剂Nimodipine、PKA抑制剂KT5720、PKC抑制剂Chelerythrine以及raf-1蛋白激活阻断剂Sulindac Sulfide预处理细胞与单纯染毒比较,免疫组化观察磷酸化ERK1/2的变化情况。结果:（1）成功建立了微量渗透泵植埋鱼藤酮大鼠染毒模型,大鼠出现类似帕金森病的症状。HE染色显示中毒组大鼠心、肝、脾、肾出现不同程度的病理学改变,其中以肝肾改变最为显著。（2） FJB复合尼氏荧光染色显示染毒组大鼠海马内出现退变神经元,免疫组化及Western蛋白印迹法提示染毒组大鼠海马内磷酸化ERK1/2和Ras蛋白表达量与对照组比较有所增高,染毒组大鼠海马神经元[Ca2+]i升高明显,而PKC和PKA激酶的活性也有一定程度的升高。（3）成功建立体外培养海马神经元鱼藤酮染毒模型,镜下观察随着鱼藤酮染毒浓度升高、时间延长,神经元出现不同程度的形态学变化。主要表现为细胞皱缩、折光性增强甚至细胞漂浮。MTT法进一步证实鱼藤酮随着染毒浓度的升高和时间的延长,细胞活性呈下降趋势。流式细胞仪检测提示鱼藤酮体外作用可以诱导细胞凋亡,PD98059预处理复合染毒与单纯染毒比较凋亡率在染毒8h时有显著升高。不同剂量、不同时间鱼藤酮染毒处理后神经元[Ca2+]i与对照组比较均有所升高,且Nimodipine预处理可以在特定的时间里阻断[Ca2+]i的升高。不同阻断抑制剂预处理后与单纯染毒比较发现,PD98059和Sulindac Sulfide可以下调磷酸化ERK1/2的表达水平,而Nimodipine, KT5720和Chelerythrine预处理没有显著改变。结论:（1）鱼藤酮对大鼠全身毒性作用显著,对肝、肾损伤作用明显。（2）鱼藤酮体内、外作用均可以诱导大鼠海马神经元发生凋亡。鱼藤酮可以激活大鼠海马MAPK/ERK信号传导通路导致ERK1/2磷酸化水平升高,活化的ERK1/2可能参与了细胞凋亡的发生发展,并在其中起到保护作用。（3）鱼藤酮染毒条件下Ca2+在海马神经元胞体内的升高早期主要不是通过L-型Ca2+通道的作用,L-型Ca2+通道主要在鱼藤酮染毒中期发挥作用,是中期胞内Ca2+升高的主要途径。低剂量鱼藤酮刺激即会引起[Ca2+]i显著升高,但其升高有一定限度,不呈时间剂量依赖关系,尤其是染毒后期与中期比较无显著性差异。Ca2+对ERK1/2的调节可能是通过对Ras蛋白的调节而间接实现的。（4）鱼藤酮作用可以导致ERK1/2上游许多蛋白因子的激活,这些激活的蛋白因子参与了细胞一系列的相关调控,而Ras和MEK在ERK1/2的活化中起到了关键作用,鱼藤酮最终导致海马MAPK/ERK级联的激活主要依靠Ras→Raf-1→MEK→ERK1/2这一经典激活通路从而发挥其后续效应。