鳗弧菌亚精胺结合蛋白基因的鉴定及功能研究

论文摘要

生物体内普遍存在的多胺转运系统PotABCD运载体由四个功能蛋白组成：PotA是三磷酸腺苷酶，为转运系统提供能量；PotB和PotC可在双层膜上形成转运通道；PotD是一种胞质结合蛋白，有一个多胺识别区域，对亚精胺有较高的亲和性，对腐胺亲和性较低。鳗弧菌（Vibrio anguillarum）M3中发现了编码亚精胺结合蛋白的三个推定potD基因：potD1、potD2和potD3。为了研究这三个基因在鳗弧菌M3亚精胺转运中起到的作用以及对致病性鳗弧菌M3毒力的影响，本研究利用框内缺失技术构建了potD1、potD2和potD3单基因缺失突变株和多基因缺失突变株，同时利用细菌的接合转移技术，以低拷贝克隆质粒Pmmb207为载体，构建了突变株的互补株。在排除了鳗弧菌自身合成对胞内多胺含量影响的化学定义的最低培养基M9中，potD1或potD3基因的单独缺失或同时缺失突变株中多胺的含量与野生型鳗弧菌M3相比明显降低，并且其生长速度也明显下降，说明potD1和potD3基因能够参与鳗弧菌M3多胺的转运过程，是鳗弧菌中亚精胺结合蛋白的编码基因。potD1和potD3基因通过对多胺转运过程的影响间接的影响了鳗弧菌的生长能力以及对鱼的致病能力。potD2基因与potD1和potD3基因之间存在拮抗作用，potD2基因的单独缺失不会影响鳗弧菌胞内多胺的含量，虽然它不参与亚精胺转运蛋白的编码，但是potD2基因能在一定程度上抑制potD1和potD3基因的表达，所以它的单独缺失或与potD1、potD3的同时缺失能不同程度的改变鳗弧菌的生长能力和毒力等。实时荧光定量PCR的方法进一步的验证了上述基因在突变株中的表达情况，并确定鳗弧菌性状的改变是由基因表达量的变化引起的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 鳗弧菌简介
• 1.1 鳗弧菌流行病概况
• 1.2 血清型和分类
• 1.3 鳗弧菌传统毒力因子
• 2 多胺简介
• 2.1 多胺的生物学功能
• 2.2 细胞内多胺的代谢及调节
• 2.3 多胺与致病菌的毒力
• 3 多胺转运系统
• 3.1 生物体内多胺转运系统
• 3.2 亚精胺结合蛋白
• 4 基因敲除技术
• 4.1 基因敲除的概念
• 4.2 框内缺失基因敲除的原理
• 4.3 基因敲除技术的应用前景
• 5 研究目的及意义
• 第二章 缺失突变株及互补株的构建及鉴定
• 1 引言
• 2 材料和试剂
• 2.1 细菌和质粒
• 2.2 引物
• 2.3 培养条件
• 2.4 仪器试剂
• 3 实验方法
• 3.1 单基因缺失突变株的构建及鉴定
• 3.2 多基因缺失突变株的构建及鉴定
• 3.3 缺失互补株的构建及鉴定
• 3.4 potD1 缺失突变株的构建及鉴定
• 4 实验结果
• 4.1 单基因缺失突变株的鉴定
• 4.2 多基因缺失突变株的鉴定
• 4.3 互补株及 potD1 突变株的鉴定
• 5 讨论与分析
• 第三章 缺失突变株及互补株的表型分析
• 1 引言
• 2 实验方法
• 2.1 细胞内多胺含量的测定
• 2.2 生长曲线的测定
• 2.3 毒力实验
• 2.4 泳动性的检测
• 2.5 明胶酶活性实验
• 2.6 荧光定量 PCR
• 3 实验结果与分析
• 3.1 细胞内多胺的含量
• 3.2 鳗弧菌在体外培养基中的生长特征
• 3.3 毒力实验
• 3.4 鳗弧菌泳动能力检测
• 3.5 明胶酶活性检测
• 3.6 野生菌和突变株中各个基因的表达量
• 4 讨论与分析
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间即将发表的学术论文