MHCC97中肝癌干细胞的分离及其特性

论文摘要

目的：应用Hoechst 33342流式细胞荧光激活分选法对肝癌细胞系MHCC97进行分选，得到边缘群及主群两个细胞亚群。采用软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤试验分别检测边缘群及主群细胞的体内、外成瘤能力；体外诱导分析其细胞的分化潜能，从而验证肝癌边缘群细胞是否具有干细胞特性。方法：1、正常培养肝癌细胞系MHCC97并制备肝癌细胞悬液；2、肝癌细胞悬液等分为两组，一组单纯用Hoechst33342进行染色，另一组同时加入钙通道拮抗剂和相同浓度的Hoechst染料，两组细胞均染色90分钟，然后以流式细胞仪检测肝癌细胞中的Hoechst荧光，通过使用双色性反射滤镜和不同的组合滤片将每个肝癌细胞中荧光信号分为两个部分—Hoechst蓝光部分和Hoechst红光部分，采集这些光信号，并利用流式细胞软件形成二维散点图，分析两组肝癌细胞在二维散点图上的形态，通过设定“门”找出肝癌组织中的边缘群细胞，并对比两组肝癌细胞在边缘群上的不同；3、将分选得到的SP表型肝癌细胞MP表型肝癌细胞在软琼脂中培养，观察4、将SP、MP细胞按1×105、1×104、1×103的数量分别行裸鼠背部皮下接种，对比观察两组肝癌细胞在裸鼠皮下形成移植瘤的能力；5、将分选得到的SP表型肝癌细胞MP表型肝癌细胞接种于六孔板，分别加入HCPT培养液诱导，正常培养液做对照。连续3d在显微镜下观察细胞的增殖和形态变化；6、HCPT诱导后，分别收集SP、MP细胞。Trizol法提取细胞总RNA，取同期正常培养的SP、MP细胞作空白对照。RT-PCR检测诱导前后MP细胞和SP细胞甲胎蛋白、r-谷氨酰转肽酶、白蛋白、葡萄糖磷酸酶表达变化。结果：1、肝癌细胞系MHCC97生长良好，MHCC97细胞常规消化，HBSS洗涤，制备成单细胞悬液，细胞密度为1×109/L；2、流式细胞仪的双波长荧光分析结果显示在Hoechst荧光的二维散点图上，有低荧光边缘细胞群，即SP亚群存在，约占整个肝癌细胞总数的3.9%左右，加入钙通道拮抗剂后SP细胞明显减少，位于边缘部分的大部分肝癌细胞因低荧光的特征消失而进入到了主细胞群中，这表明肝癌细胞的这种SP表型与ABC载体的主动外泵作用有关；3、分选得到的SP细胞在软琼脂培养基中培养后可见细胞克隆形成，其克隆形成率较高；而MP表型的肝癌细胞在同样的生长条件下则生长迟缓，软琼脂培养中细胞克隆形成也较少，说明SP表型的肝癌细胞具有非常高的增殖潜能；4、裸鼠成瘤实验中只需接种1×103数量的SP细胞便可以在4周后形成明显的皮下移植瘤，MP细胞则至少需1×105数量的细胞才能形成皮下移植瘤，显示出SP表型肝癌细胞具有很高的致瘤能力；5、HCPT诱导3天后，细胞形态发生变化。SP细胞形态变大、伸展，约15%细胞出现双核，甚至多核，约87%细胞核内有24个核仁，MP细胞诱导后只有约2%细胞出现双核，约90%的细胞核只有一个核仁；6、RT-PCR显示诱导前SP细胞AFP和GGT表达均强于MP细胞；SP细胞诱导后AFP和GGT的表达较诱导前明显降低；ALB的表达则高于诱导前；仅诱导后的SP细胞表达G6P；MP细胞诱导后AFP、GGT和ALB的改变均没有SP细胞明显，且G6P在诱导前后均未表达，提示SP细胞在体外失去了肝癌细胞生长特性,表现出成熟肝细胞生长特性。结论：1、利用Hoechst/FACS可以从人肝癌细胞系MHCC97中分离得到SP表型的肝癌细胞；2、SP表型的肝癌细胞体内、外成瘤能力，分化潜能均显著高于MP表型的肝癌细胞，表明MHCC97中SP亚群富集具有干细胞特性的癌细胞，即肝癌干细胞。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 肝癌细胞系MHCC97中边缘群细胞的分选
• 1 材料
• 1.1 实验细胞和主要试剂
• 1.2 主要工作液
• 1.3 主要实验设备
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 肝癌细胞系MHCC97中SP亚群并研究其干细胞特性
• 1 材料
• 1.1 实验细胞和主要试剂
• 1.2 主要工作液
• 1.3 主要实验设备
• 2 方法
• 2.1 琼脂集落形成实验
• 2.2 裸鼠成瘤实验
• 2.3 体外诱导
• 2.4 RT-PCR检测诱导后细胞甲胎蛋白（AFP）、r-谷氨酰转肽酶（GGT）、白蛋白（ALB）、葡萄糖磷酸酶（G6P）表达变化
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢