催产素诱导下ES源性心肌样细胞与原代小鼠心肌细胞的特性比较研究

论文摘要

胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）来源于早期胚胎的内细胞团或桑椹团,为具有多分化潜能的细胞。在特定环境下,ES细胞可在体外转化为多种细胞类型,包括心肌细胞。在ES细胞向心肌细胞分化的过程中,诸多细胞因子及药物对其具有影响作用,如HGF、EGF、bFGF、TGF2β、RA等。这些细胞因子促进了ES细胞向心肌细胞的转化,并提高了其转化的准确性。催产素（oxytocin OT）主要表达在下丘脑,常被认为用于调节生殖功能,例如促进子宫收缩、乳汁释放反射、排卵。近来发现OT/OTR在心脏有表达。最新的研究表明,在妊娠7天的鼠体内催产素受体明显增高,而这一时期正是心肌细胞开始转化、形成的时期。并有实验证明,催产素能够诱导胚胎性癌细胞P19向心肌细胞的转化。由于ES细胞在体外向心肌细胞分化与体内完整胚胎心肌发育过程相符,因此,以上均提示催产素在ES细胞向心肌细胞诱导的过程中可能具有协助作用。国外最新研究发现小鼠胚胎干细胞经催产素诱导后的可产生自发的、有节律性搏动的细胞团,RA等普通诱导剂诱导分化的心肌样细胞类似,但始终缺乏同原代心肌细胞结构与功能方面乃至生理特性方面的比较。研究目的:1)研究视黄醇在白血病抑制因子（LIF）维持小鼠胚胎干细胞（mESC）多潜能性中的协同作用,2)为催产素诱导下的ES源性心肌样细胞与原代小鼠心肌细胞在生理学特性及标志物表达上的差异。研究方法:采用小鼠ES细胞（S6）,第一部分实验中,通过倒置相差显微镜观察两组碱性磷酸酶（ALP）染色情况及mESC的形态变化,通过RT-PCR及Western blot检测Oct-4和Nanog mRNA及蛋白表达,并评价两组ESC未分化状态。第二部分实验将先前未分化状态较好的ESC经复苏,传代,在体外经催产素诱导下向心肌细胞分化,诱导后第10天,分化细胞经心肌标志物α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、肌钙蛋白T（cTnT）、心钠肽（ANF）的免疫细胞组织化学染色后,倒置显微镜及光镜下观察其细胞形态和染色结果;通过Western-bolt方法分析心肌特异性蛋白的表达情况;在电镜下观察分化细胞及小鼠原代心肌细胞的特异性结构,比较分化细胞与原代小鼠各项指标的差异;通过添加去甲肾上腺素和乙酰胆碱观察ES源性心肌细胞的正性和负性变时效应。研究结果:1.第一部分实验中,两组14d后,实验组大部分细胞集落形态维持较好,立体感强;ALP染色强阳性;对照组中仅有35%ESC处于未分化状态,ALP染色弱阳性;实验组未分化细胞数量（7.02±0.34）明显高于对照组（4.28±0.37,P＜0.05）。RT-PCR及Western blot结果显示:实验组Nanog及Oct-4 mRNA表达（分别为204.95±11.24,160.69±11.52）均高于对照组（分别为122.89±9.25,88.21±4.69,P＜0.05）;实验组Nanog及Oct-4蛋白的表达（分别为238.14±14.72、187.16±9.02）均明显高于对照组（分别为205.04±10.03,132.41±15.78,P＜0.05）。2.第二部分实验中,催产素诱导的胚胎干细胞源性心肌样细胞和小鼠原代心肌细胞cTnT免疫细胞组织染色阳性,阳性率为分别54.8%和61.2%,实验组心钠素、肌钙蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白表达分别为198.31±2.68 169.29±8.55 190.13±19.15,原代小鼠心肌相分别为197.97±2.00171.98±8.31 189.95±16.24,两组比较各项均无明显差异（P＞0.05）;电镜下观察ES源性心肌样细胞可见排列整齐的肌原纤维、肌小节结构和Z带、以及缝隙连接、桥粒连接。添加去甲肾上腺素后,ES源性心肌样细胞和原代小鼠心肌细胞的搏动频率明显增加,但两者之间无明显差别（27.3±6.41 vs26.17±6.15,P＞0.5）,反之,添加乙酰胆碱后,两组细胞的搏动频率减慢,两者间无明显差别（24.66±7.12 vs 24.25±5.47,P＞0.5）。结论:1、在维持胚胎干细胞未分化潜能方面,中等浓度LIF因子作用时添加视黄醇对维持mESC多潜能性有明显作用,推测这一作用是通过视黄醇刺激Nanog过表达实现的。2、催产素诱导下ES源性心肌样细胞在结构与受体表达等方面已与原代心肌细胞非常的接近,该心肌样细胞与原代小鼠心肌细胞相比,在自律性、传导性与原代心肌细胞相同。3、ES源性心肌样细胞在标志物α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、肌钙蛋白T（cTnT）、心钠素（ANF）表达上与小鼠原代心肌细胞相比无明显差异。4、ES源性心肌细胞上的肾上腺素受体以及胆碱能受体的功能与小鼠原代心肌细胞无差别。由此可以推测,催产素诱导下的小鼠ES源性心肌样细胞在功能上可以部分达到原代心肌的标准,为下一步的体内移植提供了很好的细胞来源。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 视黄醇在白血病抑制因子维持小鼠胚胎干细胞未分化状态中的协同作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二.催产素诱导下ES源性心肌样细胞与原代小鼠心肌细胞的特性比较研究
• 1 材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 硕士期间发表文章
• 致谢