高产乙偶姻枯草芽孢杆菌的代谢工程改造

论文摘要

乙偶姻（3-羟基-2-丁酮）天然存在于一些水果中，是一种重要的食用香料，也可作为合成其它化合物的前体物质。目前乙偶姻的主要生产方法分为化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。随着化石资源的日益枯竭，利用微生物转化廉价原料生产大宗化学产品受到越来越多的青睐，同时微生物发酵法还具备安全性高和环境污染小等优点。（1）本课题首先筛选到一株高产乙偶姻菌株，通过生物学鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），并将其命名为B. subtilis JAN3-10。该菌株利用150g L-1葡萄糖，发酵144h可生产42.2g L-1乙偶姻和15.6g L-1的2,3-丁二醇，乙偶姻得率为57.5%，生产效率为0.29g （L h）-1。该菌株在发酵过程中存在乙偶姻和2,3-丁二醇相互转化的现象：乙偶姻和2,3-丁二醇的比例在发酵中前期为1：2，后期2,3-丁二醇被逆向转化为乙偶姻，两者比例变为2.7：1。（2）通过传统诱变方法对B. subtilis JNA3-10进行复合诱变，获得一株2,3-丁二醇脱氢酶（BDH）缺失型乙偶姻高产突变株JAN-UD-6。该突变株消耗150g L-1葡萄糖，可得到53.9g L-1的乙偶姻和6.5g L-1的2,3-丁二醇，乙偶姻得率为73.5%，生产效率上升到0.37g （L h）-1。对突变株的BDH编码基因进行序列分析，该基因发生了一个无义突变（g.353T>A），使其不能编码完整的BDH。本课题又通过基因工程手段敲除了JNA3-10的bdhA基因，证明阻断乙偶姻向2,3-丁二醇的代谢流是提高乙偶姻产量的关键因素。工程菌BM虽然在乙偶姻产量上低于诱变菌JNA-UD-6，但是工程菌的发酵周期缩短至96h，乙偶姻生产效率达到了0.50g （L h）-1。（3）克隆了来自JNA3-10的α-乙酰乳酸合成酶（ALS）和α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）基因alsS和alsD。在大肠杆菌BL21中分别对ALS和ALDC进行表达、纯化和初步的酶学性质研究，随后将ALS、ALDC、ALS+ALDC分别在BM菌株中进行过量表达，发现三株重组菌株的乙偶姻产量与BM菌株相比分别提高了5.2%、4.1%和10.8%，但是菌体生长在发酵前期由于蛋白过量表达受到抑制，导致发酵周期延长，生产效率没有提高，最终乙偶姻产量达到53.5g L-1，生产效率仍为0.50g （L h）-1。（4）为了克服蛋白过量表达对菌体生长的抑制，克隆了AR/BDH编码基因上游启动子PbdhA，对其进行了功能验证，证明了强启动子HpaII活力约是PbdhA启动子的5.7倍。随后在菌株BM中表达了alsSD操纵子的正向调控蛋白ALsR，证明了ALsR对ALS和ALDC的表达起到正向作用，发现利用PbdhA启动子适度表达ALsR对菌体生长的抑制作用明显减弱并且有效促进了乙偶姻的发酵，最终重组菌乙偶姻产量达到56.5g L-1，乙偶姻生产效率达到0.59g （L h）-1。（5）为了降低乙偶姻发酵过程中2,3-丁二醇、乳酸、乙醇等NADH依赖型副产物的产量，本研究鉴定了编码枯草芽孢杆菌中生成水的NADH氧化酶（NOX）基因yodC，随后分别利用HpaII和PbdhA启动子在枯草芽孢杆菌中表达了该蛋白。结果表明适度表达NOX使得乙偶姻和乙酸产量有所上升，2,3-丁二醇、乳酸、乙醇的产量明显下降。最终在发酵84h后乙偶姻的产量达到56.7g L-1，生产效率达到0.68g （L h）-1。（6）本研究克隆了编码枯草芽孢杆菌6-磷酸果糖激酶（PFKA）和丙酮酸激酶（PK）的编码基因pfkA和pyK，并分别将其在菌株BM中过量表达。结果表明过量表达PFKA或者PK能有效提高糖酵解速率以及发酵过程的生物量，并且过量表达PFKA与过量表达PK相比更有利于乙偶姻的合成。本研究随后整合了过量表达PFKA、适度表达ALsR和NOX的策略，并对ALsR和NOX的表达顺序作了优化，最后工程菌经葡萄糖流加发酵96h，可以生产85.6g L-1乙偶姻，生产效率达到0.89g （L h）-1。本研究首先通过传统的菌种选育手段获得了生产乙偶姻的食品安全菌株，随后利用代谢工程改造构建了高产乙偶姻的基因重组菌株，最终重组菌与出发菌株B. subtilis JNA3-10相比，乙偶姻产量和产率分别提高了102.8%和200.7%。本文为利用代谢工程改造乙偶姻生产菌株的研究提供了一定的理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 香精香料的发展趋势
• 1.2.1 香精香料的简介
• 1.2.2 香精香料的发展
• 1.3 乙偶姻理化性质及生理意义
• 1.3.1 乙偶姻的理化性质
• 1.3.2 乙偶姻的生理意义
• 1.4 乙偶姻的应用
• 1.5 乙偶姻生产方法及研究概况
• 1.5.1 化学合成法
• 1.5.2 酶转化法
• 1.5.3 微生物发酵法
• 1.6 乙偶姻相关代谢途径与代谢调控
• 1.6.1 乙偶姻相关代谢途径
• 1.6.2 乙偶姻代谢途径的改造研究
• 1.7 本论文立题意义与目的
• 1.8 本论文研究思路与主要内容
• 第二章 高产乙偶姻枯草芽孢杆菌的筛选与鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 样品采集
• 2.2.2 实验试剂与设备
• 2.2.3 培养基和培养条件
• 2.2.4 菌株初筛流程
• 2.2.5 菌株复筛流程
• 2.2.6 细菌DNA的提取
• 2.2.7 PCR反应及其产物回收
• 2.2.8 菌株的生理生化鉴定及 16S rDNA分析
• 2.2.9 GC-MC定性分析发酵液主要产物
• 2.2.10 发酵参数分析方法
• 2.2.11 菌株生长曲线的绘制
• 2.2.12 最适种龄和最佳接种量的选择
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 样品初筛
• 2.3.2 样品复筛
• 2.3.3 菌株 3-1 和 3-10 发酵生产乙偶姻的能力比较
• 2.3.4 菌株 3-10 主要发酵产物的GC-MS检测
• 2.3.5 菌株 3-10 的生理生化及透射电镜鉴定结果
• 2.3.6 JNA 3-10 生长曲线的绘制
• 2.3.7 最佳接种时间和最适接种量的选择
• 2.3.8 葡萄糖浓度对菌株JNA 3-10 生产乙偶姻的影响
• 2.3.9 发酵温度和初始pH对菌株JNA 3-10 生产乙偶姻的影响
• 2.3.10 5 L发酵罐乙偶姻发酵结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 高产乙偶姻枯草芽孢杆菌突变株的选育及其机理探讨
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验试剂、仪器、培养基与培养条件
• 3.2.2 制备菌悬液
• 3.2.3 紫外（UV）致死诱变剂量的选择
• 3.2.4 硫酸二乙酯（DES）致死诱变剂量的选择
• 3.2.5 UV和DES复合诱变方法
• 3.2.6 BDH缺失型枯草芽孢杆菌筛选原理及方法
• 3.2.7 粗酶液制备及AR/BDH酶活力检测
• 3.2.8 枯草芽孢杆菌染色体的提取
• 3.2.9 枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻实验
• 3.2.10 感受细胞的态制备与转化
• 3.2.11 bdhA基因的克隆及敲除
• 3.2.12 发酵参数分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 B. subtilis JNA3-10 UV致死曲线
• 3.3.2 B. subtilis JNA3-10 DES致死曲线
• 3.3.3 UV或DES单独诱变结果
• 3.3.4 UV和DES复合诱变初筛结果
• 3.3.5 UV和DES复合诱变复筛结果
• 3.3.6 JNA-UD-6 的bdhA基因序列分析
• 3.3.7 JNA-UD-6 的发酵特征
• 3.3.8 bdhA基因的敲除对JNA 3-10 发酵生产乙偶姻的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 枯草芽孢杆菌乙偶姻合成途径代谢流的加强
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株、质粒与引物
• 4.2.2 主要试剂、相关培养基与培养条件
• 4.2.3 枯草芽孢杆菌染色体的提取
• 4.2.4 PCR反应及其产物回收
• 4.2.5 感受态细胞的制备与转化
• 4.2.6 重组菌构建及验证
• 4.2.7 重组菌蛋白表达及总蛋白浓度测定
• 4.2.8 ALS及ALDC酶活检测分析
• 4.2.9 组氨酸标签蛋白的Ni-NTA纯化
• 4.2.10 酶学性质的初步分析
• 4.2.11 发酵参数分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 枯草芽孢杆菌JNA 3-10 alsS和alsD基因的克隆及其序列分析
• 4.3.2 大肠杆菌重组表达质粒pET28a-alsS和pET28a-alsD的构建
• 4.3.3 重组大肠杆菌的SDS-PAGE分析
• 4.3.4 ALS和ALDC的蛋白纯化
• 4.3.5 ALS和ALDC的酶学性质分析
• 4.3.6 增强表达ALS和ALDC对枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻的影响
• 4.4 本章小结
• 4.4.1 主要结论
• 4.4.2 展望
• 第五章 适度表达正向调控蛋白ALsR加强乙偶姻的合成
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株、质粒与引物
• 5.2.2 主要试剂、相关培养基与培养条件
• 5.2.3 枯草芽孢杆菌染色体的提取
• 5.2.4 PCR反应及其产物回收
• 5.2.5 感受态细胞的制备与转化
• 5.2.6 重组质粒的构建
• 5.2.7 GFP表达检测
• 5.2.8 CAT酶活检测分析
• 5.2.9 重组菌蛋白表达及SDS-PAGE分析
• 5.2.10 RNA的提取和cDNA合成
• 5.2.11 RT-PCR引物设计原则
• 5.2.12 RT-PCR操作
• 5.2.13 发酵参数分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 启动子HpaII和PbdhA活力的定性比较
• 5.3.2 启动子HpaII和PbdhA活力的定量比较
• 5.3.3 增强ALsR的表达对提高发酵过程中ALS和ALDC酶活力的作用
• 5.3.4 增强ALsR的表达对乙偶姻发酵的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章 利用辅因子工程降低乙偶姻发酵过程中NADH依赖型副产物的合成
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 菌株、质粒与引物
• 6.2.2 主要试剂、相关培养基与培养条件
• 6.2.3 枯草芽孢杆菌染色体的提取
• 6.2.4 PCR反应及其产物回收
• 6.2.5 感受态细胞的制备与转化
• 6.2.6 NOX酶活力测定方法
• 6.2.7 重组菌蛋白表达及SDS-PAGE分析
• 6.2.8 酶纯化方法
• 6.2.9 NOX酶学性质分析方法
• 6.2.10 胞内NADH和NAD+含量的检测
• 6.2.11 发酵参数分析方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 枯草芽孢杆菌NOX编码基因的克隆与鉴定
• 6.3.2 YODC（NOX）的纯化
• 6.3.3 NOX的酶学性质分析
• 6.3.4 NOX的表达对枯草芽孢杆菌生长的影响
• 6.3.5 NOX的表达对细胞NADH/NAD+的影响
• 6.3.6 NOX的表达对枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻和 2,3-丁二醇的影响
• 6.3.7 NOX的表达对枯草芽孢杆菌发酵过程中其它主要副产物的影响
• 6.4 本章小结
• 第七章 代谢工程策略构建高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 菌株、质粒与引物
• 7.2.2 主要试剂、相关培养基与培养条件
• 7.2.3 枯草芽孢杆菌染色体的提取
• 7.2.4 PCR反应及其产物回收
• 7.2.5 重组质粒构建过程
• 7.2.6 感受态细胞的制备与转化
• 7.2.7 PFK和PK的酶活力测定方法
• 7.2.8 胞内ATP和NADH的检测方法
• 7.2.9 发酵参数分析方法
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 重组菌的构建及其相关酶活力检测
• 7.3.2 PFKA和PK的表达对乙偶姻发酵的影响
• 7.3.3 PFKA和PK的表达对胞内ATP和NADH含量的影响
• 7.3.4 整合代谢工程策略构建高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌
• 7.3.5 本论文利用代谢工程策略构建高产乙偶姻枯草芽孢杆菌进展
• 7.4 本章小结
• 主要结论与展望
• 主要结论
• 展望
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录 Ⅰ: 英文简写缩略表
• 附录 Ⅱ: 核苷酸序列
• 附录 Ⅲ: 作者在攻读博士学位期间发表的论文