普通菜豆P5CS基因的克隆、功能验证及单核苷酸多态性

论文摘要

普通菜豆(Phaseoleae vulgaris L.)是人类主要食用豆类作物之一,干旱、盐害等逆境已成为影响普通菜豆生产的主要限制因素。因此,研究普通菜豆抗逆分子机理,发掘并利用抗旱、耐盐基因,改良普通菜豆品种,对保障我国粮食安全、降低生产成本具有重要理论和现实意义。本研究利用候选基因法克隆普通菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS,应用实时定量PCR分析基因对逆境胁迫的应答,通过转化模式植物研究其抗逆功能,并应用直接测序法检测基因的单核苷酸多态性(SNP),获得以下结果:1、克隆出两个普通菜豆脯氨酸合成酶基因,分别命名为PvP5CS1和PvP5CS2。PvP5CS1基因全长2.246 kb,具有一个2.151 kb的开放阅读框;PvP5CS2基因全长2.340 kb,包含一个2.148 kb的开放阅读框,其DNA序列包含20个外显子和19个内含子。PvP5CS1和PvP5CS2基因与豇豆VaP5CS基因核苷酸序列的相似性分别为95.1%和82.6%,氨基酸序列的相似性分别为93.2%和79.9%。两个基因都包含有高等植物P5CS蛋白质的主要功能域:ATP结合位点、2个亮氨酸结构域、NADPH结合位点、谷氨酰激酶结构域和谷氨酸半醛结构域。2、PvP5CS1和PvP5CS2基因的表达明显受干旱、NaCl和低温诱导。干旱胁迫下,叶片中两个基因的表达在第4天达到最大值,脯氨酸的积累到第8天才达到最大值。盐胁迫2 h,叶片中两个基因出现表达高峰,根中到6 h才达到最大值,但是脯氨酸含量的最大值都出现在第9 h。冷处理2 h,诱导叶片中两个基因和根中PvP5CS2基因达到表达高峰,叶片和根中脯氨酸积累的高峰分别出现在第12 h和24 h,冷胁迫抑制PvP5CS1基因在根中表达。3、正常条件(CK)、渗透胁迫(150 mM和250 mM甘露醇)和盐胁迫(150 mM NaCl)下,转PvP5CS1基因拟南芥株系平均脯氨酸含量分别是野生型的1.38、2.68、1.30和1.30倍。转基因拟南芥的渗透耐性、耐盐性和抗旱性得到改善。在150 mM NaCl和150 mM甘露醇胁迫下,转基因株系种子的发芽率显著高于野生型(P<0.001),幼苗相对电导率比均显著低于野生型,根长显著大于野生型(P<0.05);300 mM NaCl处理15 d,转基因株系幼苗的存活率显著高于野生型(P<0.05);干旱胁迫下,转基因株系的存活率大于野生型。4、转PvP5CS2基因烟草植株表现出较强的抗旱性,在水分胁迫条件下,转基因植株脯氨酸含量、叶片萎蔫数和叶片相对含水量分别是野生型的2.3倍、0.88倍和1.26倍。5、在27份普通菜豆的PvP5CS2中共发现63个SNP位点,其中编码区18个,非编码区45个,转换:颠换为1.25:1;插入缺失位点224个,全部出现在内含子区域。PvP5CS2是一个相对保守的基因,在进化过程中受到强烈负选择影响(Ka/Ks<0.5),核苷酸多样性值(π)为0.00483,安第斯基因库和中美洲基因库内部核苷酸的变异低于基因库之间的变异。PvP5CS2基因的单核苷酸多态性和普通菜豆的抗旱性没有直接关系,但与普通菜豆的起源密切相关。6、基于普通菜豆G19833和DOR364基因组序列之间的插入缺失开发的扩增片段长度多态性分子标记Pv97,能有效追踪普通菜豆的基因源。根据Pv97标记在重组近交系(G19833×DOR364)中的多态性,将PvP5CS2基因定位在b01染色体上。7、洋葱鳞茎表皮细胞的瞬时表达结果显示,PvP5CS1和PvP5CS2定位于细胞膜和细胞核。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 普通菜豆国内外研究进展
• 1.1.1 普通菜豆的起源
• 1.1.2 普通菜豆基因组学研究进展
• 1.1.3 中国普通菜豆的研究状况
• 1.2 植物抗逆基因工程研究进展
• 1.2.1 干旱和盐渍对农业生产的危害及应对策略
• 1.2.2 植物抗逆的分子反应机制
• 1.2.3 植物抗逆相关基因克隆研究进展
• 1.2.4 植物转抗逆相关基因研究进展
• 1.3 脯氨酸代谢的作用及基因工程研究进展
• 1.3.1 脯氨酸代谢的生化途径
• 1.3.2 逆境胁迫下植物脯氨酸积累的生物学意义
• 1.3.3 脯氨酸合成酶基因研究进展
• 1.3.4 转脯氨酸合成酶基因植物研究进展
• 1.4 单核苷酸多态性研究进展
• 1.5 本研究的目的意义和技术路线
• 1.5.1 目的意义
• 1.5.2 技术路线
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 载体与菌株
• 2.1.3 酶及其它试剂耗材
• 2.1.4 试剂盒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 普通菜豆幼苗的培养
• 2.2.3 普通菜豆材料总RNA的提取
• 2.2.4 反转录
• 2.2.5 RT-PCR 扩增PvP5CS1 cDNA 序列
• 2.2.6 PCR 产物的回收与纯化
• 2.2.7 JM109 感受态的制备
• 2.2.8 PCR 产物的连接与转化
• 2.2.9 质粒提取
• 2.2.10 测序
• 2.2.11 RT-PCR 扩增PvP5CS2 cDNA 序列
• 2.2.12 3'-RACE 扩增PvP5CS2 3'cDNA 序列
• 2.2.13 实时定量PCR
• 2.2.14 普通菜豆叶片和根中脯氨酸含量的测定
• 2.2.15 拟南芥在1×MS 固体培养基上的培养
• 2.2.16 拟南芥在营养土上的培养
• 2.2.17 拟南芥表达载体pCHF3-35S-PvP5CS1的构建
• 2.2.18 pCHF3-35S-PvP5CS1质粒电击转化农杆菌
• 2.2.19 PvP5CS1 转化拟南芥
• 2.2.20 烟草病毒表达载体pCAPE2-PvP5CS2 的构建
• 2.2.21 农杆菌电击转化
• 2.2.22 烟草的转化
• 2.2.23 瞬时表达载体构建
• 2.2.24 基因枪轰击洋葱表皮
• 2.2.25 普通菜豆DNA提取
• 2.2.26 PvP5CS2 基因组序列的扩增
• 2.2.27 质粒大量提取
• 2.2.28 普通菜豆抗旱性鉴定方法
• 2.3 数据统计分析
• 2.3.1 数据统计
• 2.3.2 序列分析
• 2.3.3 中性检验
• 2.3.4 系统进化树构建
• 第三章 结果与分析
• 3.1 普通菜豆PvP5CS1 的克隆
• 3.1.1 PvP5CS1 全长cDNA 序列的克隆
• 3.1.2 PvP5CS2 全长cDNA 序列的克隆
• 3.1.3 PvP5CS1 和PvP5CS2 与其它植物P5CS 同源性分析
• 3.1.4 PvP5CS1 和PvP5CS2 蛋白质结构比较
• 3.2 PvP5CS1 和PvP5CS2 对逆境胁迫的应答
• 3.2.1 普通菜豆Actin 的克隆
• 3.2.2 逆境胁迫下普通菜豆幼苗表型变化
• 3.2.3 叶片中PvP5CS1 和PvP5CS2 对干旱胁迫的应答与脯氨酸积累
• 3.2.4 叶片中PvP5CS1 和PvP5CS2 对盐胁迫的应答与脯氨酸积累
• 3.2.5 根中PvP5CS1 和PvP5CS2 对盐胁迫的应答与脯氨酸积累
• 3.2.6 叶片中PvP5CS1 和PvP5CS2 对冷胁迫的应答与脯氨酸积累
• 3.2.7 根中PvP5CS1 和PvP5CS2 对冷胁迫的应答与脯氨酸积累
• 3.3 转PvP5CS1 拟南芥对渗透胁迫的反应
• 3.3.1 拟南芥pCHF3-PvP5CS1 表达载体
• 3.3.2 转基因拟南芥阳性植株的鉴定及纯系获得
• 3.3.3 转基因拟南芥种子在渗透胁迫下的发芽率
• 3.3.4 转基因拟南芥幼苗耐渗透性
• 3.3.5 转基因拟南芥株系耐盐性
• 3.3.6 转基因拟南芥株系的抗旱性鉴定
• 3.4 转PvP5CS2烟草抗旱性鉴定
• 3.4.1 转PvP5CS2 烟草表达载体构建
• 3.4.2 转GFP 植株荧光检测
• 3.4.3 转PvP5CS2 植株的分子检测
• 3.4.4 转基因烟草抗旱性
• 3.5 PvP5CS1 和 PvP5CS2 亚细胞定位
• 3.6 PvP5CS2 的单核苷酸多态性
• 3.6.1 PvP5CS1 和PvP5CS2 cDNA 序列的单核苷酸多态性
• 3.6.2 PvP5CS2 基因组序列的扩增
• 3.6.3 PvP5CS2 单核苷酸多态性分布
• 3.6.4 PvP5CS2 的单核苷酸多态性与普通菜豆抗旱性的关系
• 3.6.5 PvP5CS2 的单核苷酸多态性与普通菜豆进化的关系
• 3.6.6 PvP5CS2 的核苷酸多样性与中性检验
• 3.6.7 PvP5CS2 的非同义替代和同义替代比
• 3.6.8 PvP5CS2 的连锁不平衡分析
• 3.6.9 PvP5CS2 分子标记开发
• 3.6.10 PvP5CS2 在染色体上的精确定位
• 第四章 讨论
• 4.1 高等植物P5CS 基因序列的相似性
• 4.2 高等植物P5CS 对逆境胁迫的应答
• 4.3 转P5CS 植物对渗透胁迫的反应
• 4.4 PvP5CS2 的单核苷酸多态性与普通菜豆的抗旱性
• 4.5 PvP5CS2 的单核苷酸多态性与自然选择
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 附录 1 Pv97 在 221 份普通菜豆材料中的多态性
• 附录2 普通菜豆Actin 基因
• 附录3 DOR364 和G19833 PvP5CS2 基因组序列比对
• 致谢
• 作者简历