过量施肥下不同氮肥对土壤细菌多样性影响的RFLP分析

论文摘要

土壤微生物对外界因素的影响最为敏感。因此,施肥后土壤中的微生物能最快地做出响应。化肥施入后所造成的局部高浓度就形成了营养斑。而土壤微生物中,细菌的种类和数量最多。通过对干旱土壤的室内模拟过量施肥,可得到营养斑内土壤细菌多样性的变化情况,从而能更加地深入了解营养斑对土壤微生物生态的影响,同时也为土壤肥际微域中氮素转化与循环研究提供指导意义。本文以西北地区土垫旱耕人为土（Earth-cumuli-Orthic Anthrosols）为研究对象,已经过拔肥处理。过量施肥按正常施肥量的10倍处理,氮肥分别为酰胺态氮尿素、硝态氮硝酸钠和铵态氮碳酸氢铵,磷肥和钾肥分别为KH2PO4和K2SO4。4种试验处理:处理1（T1）氮肥为尿素,处理2（T2）氮肥为硝酸钠,处理（T3）氮肥为碳酸氢铵和处理（T4）尿素量为5倍的T1,以不施肥处理土样（CK）做对照。控制土壤水分为最大毛管持水量的80%,置于28℃恒温培养箱中避光培养15d。通过直接法提取土壤微生物总DNA,采用细菌16S rDNA通用引物对（63F/1387R）进行PCR扩增,产物与pMD19-T载体连接后利用JM109建立5个细菌的16S rDNA克隆文库。用pMD19-T载体通用引物M13,PCR扩增阳性克隆的16S rDNA片段,纯化产物分别用Hha I和Rsa I两种限制性内切酶消化。通过对每个克隆文库的近200个阳性克隆的PCR-RFLP的分析,获得如下研究结果:（1）不同处理土壤分别得到17（T1）、25（T2）、130（T3）、49（T4）和119（CK）个酶切分型;克隆文库大小分别为97.16%、92.63%、54.15%、81.35%和60.00%;各文库都出现了优势菌种。（2）采用α多样性的测度对试验结果进行分析统计表明,不同处理间土壤细菌的丰富度指数和Shannon-wiener指数为:T3>CK>T4>T2>T1;Simpson指数（Ds）和均匀度指数为:CK>T3>T4>T2>T1。4个指数的变异系数（CV%）分别为:70.64%、36.69%、9.71%和17.21%,说明用丰富度指数来比较各处理间的细菌多样性差异更能有效地反映本实验结果。由丰富度指数可以得出,铵态氮处理土壤中细菌多样性比对照土样还高,而其他处理土样的多样性都比对照样品少,其中T1的最低。（3）对各优势菌种16S rDNA测序,经NCBI比对后表明,酰胺态氮处理（T1）都为不可培养细菌;硝态氮处理（T2）以不可培养菌和γ-变形杆菌纲为主;铵态氮处理出现了β-变形菌纲（β-protrobacteria）的亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、γ-变形菌纲（γ-proteobacteria）的寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）和芽孢杆菌纲（Bacilli）的芽孢杆菌属（Bacillus）;5倍T1尿素量的T4以不可培养菌和γ-变形杆菌门为主。此外,CK、T1和T3都出现了酸杆菌属（Acidobacterium）。由此说明了,在过量施肥下,铵态氮处理不仅从克隆文库来说呈现了多样性,从优势菌来说也呈现出了多样性。从T3中占最多的（6.83%）优势菌亚硝酸菌属（Nitrosospira）说明了,在这种高浓度的施肥量下,铵态氮处理土壤中仍可以发生硝化作用。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 土壤微生物多样性及其功能

1.1.1 土壤微生物多样性的概念

1.1.2 土壤微生物多样性的研究层次

1.1.3 土壤微生物多样性的功能

1.2 土壤微生物多样性的影响因素

1.2.1 土壤理化性质

1.2.2 生物因素

1.2.3 不同土壤经营措施

1.3 土壤微生物多样性研究方法进展

1.4 化肥与土壤细菌的相互关系

1.4.1 化肥施用现状及对对生态环境的影响

1.4.2 施肥影响土壤细菌多样性研究概况

1.4.3 细菌在氮肥转化中的作用

1.5 本试验立题依据、研究内容与技术路线

1.5.1 立题依据及研究内容

1.5.2 技术路线

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 供试土壤

2.1.2 试剂及其配制

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 引物、菌种与质粒

2.1.5 主要相关软件

2.2 试验方法

2.2.1 土壤理化性质测定

2.2.2 供试土壤预处理

2.2.3 土壤微生物总DNA 的提取与纯化

2.2.4 细菌16S rDNA 扩增与克隆文库的建立

2.2.5 RFLP 分析

2.2.6 RFLP 酶切类型的0-1 聚类分析

2.2.7 不同施肥处理样品的细菌多样性指数统计分析

2.2.8 优势菌种的16S rDNA 片段测序

2.2.9 系统发育树的构建与优势菌功能分析

第三章结果与分析

3.1 土壤微生物总DNA 提取

3.2 细菌16S rDNA 片段的扩增

3.3 克隆文库的菌落PCR

3.4 限制性内切酶Hha I 和Rsa I 分别酶切细菌16S rDNA 片段

3.4.1 对照处理的细菌16S rDNA 酶切结果

3.4.2 酰胺态氮处理土壤中细菌16S rDNA 酶切结果

3.4.3 硝态氮处理土壤中细菌16S rDNA 酶切结果

3.4.4 铵态氮处理土壤中细菌16S rDNA 酶切结果

3.4.5 尿素为五倍T1 处理土壤中细菌16S rDNA 酶切结果

3.5 RFLP 类型统计

3.6 不同施肥处理的多样性指数比较

3.7 不同施肥处理土壤的优势细菌分析

第四章讨论

4.1 土壤总DNA 的提取

4.2 施肥量与肥料比例对土壤细菌多样性的影响

4.3 优势菌与氮素循环分析

第五章结论与展望

5.1 结论

5.2 研究展望

参考文献

致谢

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