鹅FSH基因的克隆及表达初步分析

论文摘要

促卵泡激素（FSH）基因是动物繁殖性状的一个重要的候选基因,其对家禽的产蛋具有重要的调节作用。本研究利用RT-PCR结合RACE技术,获得了FSH基因的a亚基的CDS序列和β亚基的cDNA全长序列,采用qRT-PCR技术分析了鹅FSHβ基因在不同生殖周期mRNA的表达分析,并利用基因融合技术,探讨了FSH重组体在COS-7细胞中的表达及FSH信号通路中相关基因的表达变化。研究旨在为全面解析鹅FSH基因的结构特征及功能提供了一定的参考,同时也为鹅产蛋性能的改善和提高提供一定的理论依据。1.鹅FSH基因的克隆及序列分析本研究采用RT-PCR和RACE技术扩增了鹅FSHa基因CDS序列和FSHβ基因的cDNA序列,结果表明,鹅FSHa基因CDS全长363bp；鹅FSHβ cDNA全长序列包含16bp 5’UTR、396bp ORF,同时还发现FSHβ3’端UTR存在两个不同的剪接体,其大小分别为518bp和780bp。经生物信息学分析,发现FSHα、FSHβ基因均为亲水性蛋白,且都存在信号肽序列切割位点,推测其都为分泌蛋白。2. FSHβ基因在鹅不同生殖时期mRNA的表达分析选取浙东白鹅和扬州鹅为研究对象,分别采用半定量PCR和qRT-PCR检测了鹅不同组织及不同生殖时期（开产前期、产蛋期（排卵前期,排卵后期）、就巢期）FSHβ mRNA表达变化。RT-PCR结果显示,FSHβ基因在鹅垂体、下丘脑、卵巢、输卵管等生殖相关组织中的表达量较高。qRT-PCR结果表明,在开产前期、产蛋期、就巢期3个不同生殖时期垂体和输卵管FSHβ mRNA的表达量总体上要高于下丘脑和卵巢,且四个组织中FSHβmRNA表达量的变化趋势相同,均表现为先上升后下降,产蛋期达到峰值；产蛋期垂体中FSHβ mRNA的表达量与开产前期相比差异显著（P<0.05）,与就巢期相比差异极显著（P<0.01）,产蛋期卵巢和输卵管中FSHβ mRNA的表达量与开产前期相比差异均显著（P<0.05）,而下丘脑FSHβ mRNA的表达量在3个生殖周期内表达变化差异不显著（P>0.05）；产蛋期扬州鹅与浙东白鹅FSHβ mRNA表达量,只有垂体中存在极显著差异（P<0.01）。3.鹅融合基因FSH在COS-7细胞中的表达通过融合基因技术构建了四种重组FSH质粒,转染COS-7细胞,放免检测12h、24h、36h、48h细胞上清液中FSH蛋白的分泌量。转染pVITRO2-FSHβ、 pVITRO2-FSHβ-CTP的细胞,结果表明CTP序列的增加可以提高FSH蛋白的分泌量,而转染异二聚体、单体质粒的细胞,分泌FSH蛋白的量呈相反的趋势。利用qRT-PCR技术检测转染三种质粒后,FSH信号通路FSHβ、GnRH、GH、BMP基因在6h、12h、24h、36h、48h,5个时间点的表达量变化,结果表明各基因都存在一定的表达变化趋势。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 促卵泡素（FSH）研究进展
• 2.1 FSH分子研究进展
• 2.1.1 FSH分子结构
• 2.1.2 FSH的分泌机制
• 2.2 FSH基因研究进展
• 2.2.1 FSH基因的结构特征
• 2.2.2 FSH基因与动物繁殖性状的关系
• 2.2.3 调控FSH的信号通路
• 3 融合基因的研究进展
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 鹅FSH基因的克隆与生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验样品的来源及组织样品采集
• 1.1.2 实验试剂及药品
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 宿主菌和载体
• 1.1.5 溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 RNA提取
• 1.2.2 RT-PCR扩增及产物克隆测序
• 1.2.3 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA提取检测结果
• 2.2 RT-PCR扩增结果
• 2.3 RACE结果
• 2.3.1 3'RACE结果
• 2.3.2 5'RACE结果
• 2.4 鹅FSHβ cDNA序列全长获得
• 2.5 鹅FSHα、FSHβ基因的生物信息学分析
• 2.5.1 鹅FSHα基因生物信息学分析
• 2.5.2 鹅FSHβ基因生物信息学分析
• 3 讨论
• 3.1 RACE技术的影响因素
• 3.2 鹅FSHα基因克隆及序列分析
• 3.3 鹅FSHβ基因克隆与序列分析
• 3.4 鹅FSH基因的特征
• 第三章 鹅不同生殖时期FSHβ基因mRNA表达量变化
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料及来源
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 实验试剂
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 样品采集
• 1.4.2 RNA的提取
• 1.4.3 引物的设计与合成
• 1.4.4 cDNA的合成
• 1.4.5 半定量PCR反应
• 1.4.6 荧光定量PCR反应
• 1.4.7 数据处理与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同组织鹅FSHβ mRNA RT-PCR检测
• 2.2 荧光定量PCR反应
• 2.2.1 荧光定量PCR扩增的溶解曲线
• 2.2.2 浙东白鹅不同生殖时期FSHβ基因的表达变化
• 2.2.3 浙东白鹅与扬州鹅产蛋期FSHβ mRNA表达差异
• 3 讨论
• 3.1 样本的选择
• 3.2 影响荧光定量PCR的主要因素
• 3.3 不同组织鹅FSHβ mRNA表达
• 3.4 浙东白鹅不同生殖时期FSHβ基因的表达变化
• 3.5 浙东白鹅与扬州鹅产蛋期FSHβ mRNA表达差异
• 第四章 鹅融合基因FSH在cos-7细胞中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验质粒
• 1.1.2 实验载体和菌株
• 1.1.3 细胞株
• 1.1.4 实验试剂
• 1.1.5 实验仪器及设备
• 1.1.6 溶液配制
• 1.1.7 引物的合成和测序
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 CTP序列扩增
• 2-FSHβ载体的构建'>1.2.2 鹅pVITRO₂-FSHβ载体的构建
• 2-FSHαβ-CTP载体的构建'>1.2.3 鹅异二聚体pPVITRO₂-FSHαβ-CTP载体的构建
• 2-FSHβ-CTP-α的构建'>1.2.4 鹅单体pVITRO₂-FSHβ-CTP-α的构建
• 1.2.5 转染COS-7细胞
• 2 结果与分析
• 2.1 CTP扩增结果
• 2.2 FSHaβ-CTP的构建结果
• 2.2.1 FSHβ-CTP的PCR扩增结果
• 2.2.2 FSHα基因PCR扩增结果
• 2.3 单体FSHβ-CTP-α的PCR扩增结果
• 2-FSHαβ-CTP表达载体的构建'>2.4 鹅异二聚体pVITRO₂-FSHαβ-CTP表达载体的构建
• 2-FSHβ-CTP的构建'>2.4.1 pVITRO₂-FSHβ-CTP的构建
• 2-FSHαβ-CTP的构建'>2.4.2 pVITRO₂-FSHαβ-CTP的构建
• 2-FSHβ-CTP-α表达载体的构建'>2.5 鹅单体pVITRO₂-FSHβ-CTP-α表达载体的构建
• 2.6 转染细胞及表达结果
• 2.6.1 放免检测
• 2.6.2 转染融合基因重组质粒后,FSH信号通路中某些相关基因表达变化
• 3 讨论
• 3.1 融合基因注意事项
• 3.2 鹅FSH蛋白放免检测
• 3.3 转染融合基因重组质粒后,FSH信号通路中相关基因表达变化
• 3.3.1 FSHβ基因表达
• 3.3.2 GnRH基因的表达
• 3.3.3 GH基因的表达
• 3.3.4 BMP基因的表达
• 全文结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 攻读学位期间发表的会议论文
• 致谢