论文摘要
背景与目的:化疗药物耐药情况普遍存在是临床抗肿瘤用药的一大难题。生物毒素为临床抗肿瘤治疗提供了新的思路。眼镜蛇毒细胞毒素又称心脏毒素,是从眼镜蛇毒中分离出的毒性蛋白,对多种肿瘤细胞有选择性杀伤作用,在蛇毒抗肿瘤研究中占重要地位。目前研究表明它可通过细胞膜作用、线粒体途径或者溶酶体等途径发挥作用。舟山眼镜蛇细胞毒素CTX1是本课题组从舟山眼镜蛇毒中分离纯化的小分子多肽,CTX1抗肿瘤作用目前未见文献报道,本实验拟研究CTX1的抗肿瘤作用及相关作用机制。研究内容包括:1、CTX1对体外细胞株相对活力和P388腹水瘤小鼠生存期的影响。2、CTX1对肿瘤细胞死亡的影响。3、CTX1对线粒体膜通透性和凋亡蛋白Caspase 8、Caspase9的影响。4、CTX1对溶酶体膜通透性和组织蛋白酶B（Cathepsin B）的影响。5、Caspase家族广谱抑制剂Z-VAD-FMK和Cathepsin B抑制剂CA-074 Me对CTX1诱导的肿瘤细胞死亡的影响。实验方法:1 CTX1抗肿瘤作用评价1.1细胞相对活力测定:MTS法检测CTX1对多种细胞（MCF-7、H22、K562、P388和16HBE）相对活力的影响。1.2 P388腹水瘤昆明小鼠生存期评价2 CTX1对肿瘤细胞死亡的影响2.1流式细胞术检测Annexin V-FITC、PI双染后细胞死亡情况。2.2荧光显微术观察活细胞培养体系细胞死亡情况（MCF-7细胞:Annexin V-FITC、PI双染;K562细胞:PI染色）。2.3乳酸脱氢酶（LDH）活力检测3线粒体膜电位检测:Rhodamine 123染色后用流式细胞仪检测细胞荧光强度。4 CTX1对溶酶体膜通透性和Cathepsin B活性的影响4.1溶酶体特异性染色:LysoTracker Red DND-99或LysoTracker Green DND-26染色后于荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。4.2 Cathepsin B活性检测:根据Cathepsin B活性检测试剂盒处理后于全波长多功能读数仪检测。5 Western blotting检测相关蛋白（GAPDH、Caspase 8、Caspase 9、Cathepsin B）表达水平。结果:1. CTX1对体外细胞株相对活力和P388腹水瘤小鼠生存期的影响1.1用MTS方法检测细胞相对活力:CTX1对多种细胞（MCF-7、H22、K562、P388和16HBE）的活力具有抑制作用,并呈现剂量依赖和时间依赖关系。与肿瘤细胞株相比,CTX1对人支气管上皮细胞株16HBE活力的抑制作用较弱,这说明CTX1对肿瘤细胞株有选择性抑制作用。CTX1对多种肿瘤细胞株的半数抑制浓度（IC50）不同,说明CTX1对不同肿瘤细胞株具有选择性抑制作用。1.2 CTX1（1/3LD50,1.40 mg/kg/day）可明显延长P388腹水瘤小鼠的生存期及累积生存率,与阴性对照组相比具有统计学差异（P<0.05）。2. CTX1对肿瘤细胞死亡的影响2.1流式细胞术检测细胞死亡发现,CTX1诱导肿瘤细胞（K562、P388）死亡,呈现剂量依赖和时间依赖关系,主要引起细胞晚期凋亡和坏死,早期凋亡均不明显。2.2荧光显微术观察细胞死亡: K562或者MCF-7对照组绝大部分细胞大小正常,胞膜光滑,状态良好,未被PI染色。随着CTX1浓度增加和作用时间延长,PI染色的细胞数（即死亡细胞）明显增多。在MCF-7实验中, CTX1处理过的细胞基本未被Annexin V-FITC染色,说明CTX1并不诱导早期凋亡。2.3随着CTX1浓度增加,P388细胞培养体系中LDH活力逐渐增加。3 CTX1对线粒体膜通透性和凋亡蛋白Caspase 8、Caspase9的影响3.1 CTX1导致线粒体膜电位丢失:P388细胞经罗丹明123染色后用流式细胞仪检测,CTX1（1、2、4μg/ml）处理组荧光强度较对照组明显减弱,低荧光强度的P388细胞所占百分率随着CTX1剂量的增加而增加（P<0.05）。3.2 Western blotting检测结果显示:CTX1未引起GAPDH、Caspase 8、Caspase 9蛋白表达的明显变化。4 CTX1对溶酶体膜通透性和Cathepsin B的影响4.1溶酶体染色后可见CTX1处理组MCF-7或P388细胞荧光强度较阴性对照组减弱,反映了溶酶体膜完整性丢失。CTX1诱导溶酶体膜通透性增加（LMP）。4.2 CTX1引起Cathepsin B活性增加:加药处理P388细胞12 h,溶剂对照组、BSA（4μg/ml）组、CTX1（2、4μg/ml）各组CB活性（A.U./mg of protein）分别为:（8.49±0.18）、（8.09±0.14）、（25.83±2.54）、（25.17±4.25）,CTX1处理组酶活性约为溶剂对照组酶活性的3倍。CTX1组与溶剂对照组相比有显著性差异（P<0.05）。4.3 Western blotting检测结果显示:CTX1未引起Cathepsin B蛋白表达的明显变化。5 Z-VAD-FMK和CA-074 Me对CTX1诱导的肿瘤细胞死亡的影响5.1应用Z-VAD-FMK（10μM）和CA-074 Me （7.5μM）预处理P388细胞1小时,再分别用CTX1（4μg/ml）处理12 h,MTS法检测细胞相对活力,结果显示:Z-VAD-FMK和CA-074 Me均能增加CTX1作用后的P388细胞相对活力。5.2细胞处理同5.1,流式细胞术检测Annexin V-FITC、PI双染后P388细胞死亡情况,结果显示:Z-VAD-FMK和CA-074 Me均能减少CTX1作用后的P388细胞死亡。5.3细胞处理同5.1,荧光显微镜术观察细胞死亡结果显示:CA-074 Me能减少CTX1作用后的MCF-7细胞死亡,Z-VAD-FMK不能减少CTX1作用后的MCF-7细胞死亡。论:1 CTX1具有体内外抗肿瘤作用,对不同肿瘤细胞具有选择性抑制作用,该作用呈剂量依赖和时间依赖关系。2 CTX1诱导肿瘤细胞发生凋亡和坏死。3 CTX1主要引起肿瘤细胞坏死,可能的机制包括溶酶体膜的通透化和Cathepsin B的激活。
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相关论文文献
- [1].舟山眼镜蛇毒CTX1层析分离的流速优化[J]. 蛇志 2011(02)