论文摘要
1．背景中国北方太行山区是食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，SCC）和贲门腺癌（Gastric cardia adenocarcinoma，GCA）同时高发的地区。SCC和GCA好发年龄段均为50岁以上的中老年人。近年的研究提示，中国北方SCC高发区青年（=40岁）食管鳞癌和贲门腺癌并不罕见。某些学者认为：与中老年SCC患者相比，青年SCC患者癌细胞分化差，易发生浸润性生长和早期血管转移，5年生存率更低，预后极差。提示青年SCC和GCA可能有其独特的分子基础。青年患者的存在引发一个重要的学术问题：为什么在相同的生活环境中，青年患者可提前10余年发病?我们的假设是：个体的遗传易感因素可能在青年SCC和GCA发病中起更重要的作用。河南SCC和GCA高发区存在明显的SCC和GCA家族聚集现象，进一步提示遗传因素在SCC和GCA癌变中可能起重要作用。但SCC和GCA遗传易感性的分子机制尚不十分清楚。近年研究提示，RASSF1A（Ras相关区域家族1A，Ras-association domain family1A）基因是2000年克隆得到的新的肿瘤抑制基因，位于染色体3p21.3区。它所表达的产物广泛存在于肺、肝脏、消化道等多种器官和组织中，在调控细胞的增殖和凋亡中具有重要作用，体内外均能抑制肿瘤的生长。RASSF1A启动子甲基化是其失活的主要机制。但是，目前尚未见到RASSF1A基因与中国北方太行山高发区青年SCC和GCA癌变关系的报道。本研究对中国北方太行山高发区SCC和GCA高发区14814例SCC患者和7457例GCA患者进行回顾性调查，了解SCC和GCA高发区青年SCC和GCA的检出率及临床病理特点；检测部分青年SCC和GCA组织中RASSF1A启动子甲基化及蛋白表达，探讨其在SCC和GCA癌变中的作用，以加深对青年SCC和GCA遗传易感性的认识。2．材料与方法2．1材料来源所有临床病理资料均来自1974年-2006年山西省磁县人民医院和姚村食管癌医院以及1998年-2006年林州中心医院14814例SCC和7457例GCA的临床和病理记录，根据病理诊断报告和住院记录分别统计SCC患者人数、性别、年龄、病理特征等，并对这些数据进行统计分析。SCC和GCA组织标本均来自林州地区患者手术切除标本。SCC共40例，其中青年组患者13例，平均年龄39±1岁；老年组患者27例，平均年龄72±2岁。GCA共24例，其中青年组患者10例，平均年龄37±2岁；老年组患者14例，平均年龄68±3岁。食管和贲门正常组织均取自同一个体癌旁正常组织（组织病理学证实）。所有患者术前均未接受任何放疗或化疗。2．2组织处理手术切除标本一半经85％酒精固定、石蜡包埋、连续切片，进行组织病理学检查，一半立即置-80℃低温冰箱中，用于冰冻切片和DNA提取。2．3试验方法2．3．1免疫组织化学染色采用冰冻切片免疫组织化学ABC法检测RASSF1A蛋白表达，鼠抗人RASSF1A单克隆抗体（美国eBioscience公司）工作液浓度为原液的1／500。2．3．2甲基化特异性PCR对于RASSF1A基因启动子区甲基化水平的检测采用1996年Herman等提出的甲基化特异性PCR方法（methylation-specific polymerase chain reaction，MSP）。原理：DNA在亚硫酸氢盐的作用下，未甲基化的胞嘧啶（C）发生脱氨基反应转变成了尿嘧啶（U），发生甲基化的5-甲基胞嘧啶（5-mC）不发生转变，因此处理后的DNA序列将出现不同的情况，基于这两种情况设计了甲基化与非甲基化特异性引物。对同一例修饰后的DNA分别用甲基化与非甲基化特异性引物扩增，二者将至少有一个扩增。根据上面的原理，就可以由特异性引物判断原来DNA的甲基化状态。2．4统计学方法采用SPSS13.0统计软件处理，各组间的比较采用χ2检验，一致性分析采用Kappa检验，显著性水准取α=0.05。3．结果3．1青年SCC的检出率及临床病理特征3．1．1三家医院14814例SCC患者中共有青年SCC患者625例，占同期SCC患者的4％。但三家医院青年患者占同期SCC患者的比例并不相同。磁县人民医院最高（8％），分别是林州中心医院（2％）和姚村食管癌医院（4％）的4倍和2倍，差异显著（P＜0.05）。3．1．2同一家医院不同年份青年SCC患者占同期SCC患者的比例并不相同。姚村食管癌医院1976-1997的比例（7％）显著高于1998-2006年（2％）（P＜0.05）；磁县人民医院1974-1997的比例（9％）是1998-2006年（3％）的3倍（P＜0.05）。3．1．3 625例青年SCC患者男女比例为1.72，与中老年SCC患者男女比例1.71相似（P＞0.05）。3．1．4青年（24％）与中老年（26％）患者淋巴结发生转移的比例相似（P＞0.05）。其中男性淋巴结发生转移的比例高于女性（青年：25％vs．21％；中老年27％vs．25％；P＜0.05）。青年SCC高分化的比例高于中老年（10％vs．7％；P＞0.05）。青年SCC浸润纤维膜的比例低于中老年患者（P＜0.05）。3．2青年GCA的检出率等流行病学特征3．2．1三家医院33年7457例GCA患者中共有青年GCA患者196例，占同期GCA患者的3％。青年GCA的检出率三家医院相似。3．2．2青年GCA患者男女比值为2.84，低于中老年GCA患者男女比例3.36（5594／1667），但差异无统计学意义（P＞0.05）。3．3三家医院SCC和GCA流行特征比较3．3．1青年GCA占青年SCC和GCA的比值为24％，低于中老年GCA的这一比值（33％），差异有统计学意义（P＜0.05）。磁县人民医院青年GCA在SCC和GCA中的构成比最低（18％），中心医院最高30％（P=0.011）；磁县人民医院总的GCA在SCC和GCA中的构成比（36％）高于姚村食管癌医院（34％）（P＜0.05）。3．4 RASSF1A蛋白表达3．4．1青年SCC组织RASSF1A蛋白表达高于老年，差异显著（83％，40％，P＜0.05）；同样的情况见于青年GCA组织（89％，36％，P＜0.05）。3．4．2 RASSF1A在青年SCC和GCA组织中阳性表达频率均较高（83％，10／12vs 89％，8／9），与对应正常组织中的表达差异没有统计学意义（P＞0.05），但表达类型并不相同。3．4．3老年SCC组织RASSF1A蛋白表达低于食管正常上皮组织（40％，77％，P＞0.05）；同样的情况见于老年GCA组织和正常上皮组织，后者差异显著（36％，91％，P＜0.05）。3．4．4 SCC和GCA组织RASSF1A蛋白阳性表达率相似（P＞0.05）。3．5 RASSF1A基因启动子甲基化3．5．1青年SCC组织RASSF1A基因启动子甲基化率高于老年，但差异无统计学意义（46％，15％）。同样的情况见于青年和老年GCA组织（60％，30％）。3．5．2青年（60％，40％）和老年（30％，29％）GCA组织RASSF1A基因启动子甲基化率稍高于正常上皮组织，但差异无统计学意义；同样的情况见于青年SCC和正常上皮组织（46％，33％，P＞0.05）。3．6 RASSF1A基因启动子甲基化与RASSF1A蛋白表达的关系3．6．1 RASSF1A基因启动子发生甲基化的19例组织中，仅有2例（11％）出现RASSF1A蛋白阴性表达；RASSF1A基因启动子未发生甲基化的44例组织中，有21例（52％）出现RASSF1A蛋白阴性表达。3．7 RASSF1A基因启动子甲基化和RASSF1A蛋白表达与患者临床病理特征的关系。3．7．1青年与老年SCC和GCA组织RASSF1A基因启动子甲基化率与淋巴结转移，分化程度及浸润深度均没有相关性。3．7．2青年与老年SCC和GCA组织RASSF1A蛋白的阳性表达率与淋巴结转移，分化程度及浸润深度均没有相关性。4．结论4．1华北太行山高发区青年SCC和GCA并不罕见（青年SCC：2％-9％；青年GCA：2％-3％），青年SCC的组织病理特征，包括淋巴结转移，浸润深度和分化程度与中老年SCC患者相似。4．2青年SCC和GCA组织RASSF1A蛋白表达高于老年，提示青年与老年SCC和GCA具有不同的分子基础，RASSF1A蛋白阳性表达是高发区青年SCC和GCA组织中常见的分子事件。4．3青年SCC和GCARASSF1A启动子甲基化率分别为46％和60％，提示，RASSF1A启动子甲基化是青年SCC和GCA频发的分子事件，可能在青年SCC和GCA癌变中具有重要的作用。4．4 RASSF1A启动子甲基化与其蛋白表达间没有明显的相关性，提示除外启动子甲基化，可能还存在影响RASSF1A蛋白表达的其它机制，另外，RASSF1A基因启动子甲基化及蛋白表达与SCC和GCA的临床病理特征没有相关性。
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