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胰岛素样生长因子-Ⅰ在奶牛骨代谢病中的作用及机制

2020-12-05阅读(250)

胰岛素样生长因子-Ⅰ在奶牛骨代谢病中的作用及机制

论文摘要

奶牛骨代谢性疾病（bone metabolic disease,BMD）是包括软骨症、佝偻病、产后瘫痪、产褥热等一系列由钙磷代谢紊乱引起的营养代谢病。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor,IGF）-I是骨骼生长和矿化中钙磷代谢调节的关键因子,人类临床研究表明其与骨代谢性疾病密切相关。本研究从下述四个方面探讨IGF-I对奶牛骨代谢病中的影响及其机制。1.奶牛血浆IGF-I的测定及其与骨代谢相关因子的关系设计了三个独立的试验以探讨IGF-I与奶牛钙磷代谢相关因子的关系。试验I检测不同泌乳阶段钙、磷、IGF-I、甲状旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）、降钙素（calcitionin,CT）等骨代谢相关因子水平,试验Ⅱ检测不同年龄奶牛骨代谢相关因子水平,试验Ⅲ检测奶牛骨代谢病与相关因子的关系。结果显示,奶牛年龄、妊娠状况及血浆IGF-I、PTH、CT水平与机体钙磷水平密切相关,血浆Ca、IGF-I、P、ALP、PTH水平与骨代谢性疾病相关,此外IGF-I与Ca、P正相关（r=0.390,P=0.049;r=0.359,P=0.044）,PTH负相关（r=—0.790,P=0.002）。提示IGF-I与奶牛钙磷代谢密切相关,可以作为诊断奶牛骨代谢病的特异生化标志物。2.奶牛成骨细胞的体外培养、鉴定及生物特性研究采用胰蛋白酶-组织块移性法获取的细胞具有典型的成骨细胞形态和特性:ALP染色呈阳性,活性水平较高;培养7d后可检测到OC mRNA表达,12d后细胞上清液中可检测到OC蛋白;诱导培养2w后细胞可形成钙化结节。提示本实验室建立的方法所培养的细胞具有成骨细胞特性,可获得高纯度、高活性的奶牛成骨细胞。3.IGF-I对奶牛成骨细胞增殖、分化、矿化及重建的影响研究外源性IGF-I对体外培养的奶牛成骨细胞增殖、分化、矿化及重建的影响。结果显示,1-200ng/mL IGF-I均能促进奶牛成骨细胞增殖,100ng/mL组具有最大刺激效应,且IGF-I干预组细胞光密度值（optical density value,OD）从第1d到第5d逐渐增加,第7d降低。与对照组相比,10ng/mL与100ng/mL IGF-I均可显著诱导ALP活性、OC水平以及基质钙含量,钙化结节数量增加20%-180%（P＜0.05或P＜0.01）。半定量RT-PCR结果显示:10、50、100ng/mL IGF-I干预5d OPG/β-actin、RANKL/β-actin比值显著高于0ng/mL组（P＜0.05）;ELISA显示,在1-100ng/mL浓度范围内,IGF-I呈剂量依赖方式上调OPG蛋白表达,其中10、50、100ng/mL干预组与0ng/mL组差异显著（P＜0.05）。提示IGF-I是奶牛成骨细胞增殖、分化以、矿化及重建的代谢促进剂,这可能是IGF-I参与奶牛骨代谢性疾病的重要机制之一。4.IGF-I抑制血清饥饿诱导的奶牛成骨细胞凋亡研究血清饥饿对奶牛成骨细胞凋亡的诱导作用,并探讨IGF-I对血清饥饿诱导的奶牛成骨细胞的影响。结果显示,10-3 M脱氧胸苷存在时,血清饥饿2d,MTT法检测到细胞存活率为50%,经琼脂糖凝胶电泳可见梯形凋亡条带。流式细胞术分析显示,与血清饥饿组相比,100ng/mL IGF-I显著增高奶牛成骨细胞的增殖指数,降低其凋亡率（P＜0.01）。Caspase-3检测结果显示IGF-I显著抑制csspsse-3的活性（P＜0.05）。结果提示血清饥饿可诱导奶牛成骨细胞凋亡,IGF-I抑制这种凋亡诱导作用。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 英文缩略语
  • 第一部分:文献综述
  • 第1章 奶牛内环境钙磷代谢调节
  • 1.1 钙磷吸收的调节
  • 1.1.1 维生素D调节系统
  • 1.1.2 钙吸收的调节
  • 1.1.3 磷吸收的调节
  • 1.1.4 钙磷的骨代谢调节
  • 1.2 钙磷的需求量
  • 1.3 奶牛产褥热
  • 1.3.1 产褥热的发生机制
  • 1.3.2 产褥热的预防
  • 第2章 胰岛素样生长因子-Ⅰ在骨代谢中的作用
  • 2.1 IGFs系统的组成、IGF-Ⅰ的基因构成和IGF-Ⅰ骨骼分布特点
  • 2.1.1 IGF-Ⅰ的基因构成
  • 2.1.2 IGF-Ⅰ受体
  • 2.1.3 IGF结合蛋白（IGFBP）
  • 2.1.4 IGF-Ⅰ骨骼分布特点
  • 2.2 IGF-Ⅰ对成骨细胞的作用
  • 2.2.1 促进成骨细胞分化、增殖、募集
  • 2.2.2 促进成骨细胞胶原及骨钙素合成
  • 2.2.3 IGF-Ⅰ促进成骨细胞对磷的吸收及氨基酸的运输
  • 2.3 IGF-Ⅰ对破骨细胞的影响
  • 2.4 影响IGF-Ⅰ对骨代谢作用的因素
  • 2.4.1 年龄和营养因素
  • 2.4.2 激素对IGF-Ⅰ的影响
  • 2.4.2.1 生长激素
  • 2.4.2.2 甲状旁腺激素
  • 2.4.2.3 性激素
  • 3'>2.4.2.4 甲状腺激素、糖皮质激素和1,25-双羟维生素D3
  • 2.4.3 其他细胞因子对IGF-Ⅰ的影响
  • 2.4.3.1 转化生长因子-β
  • 2.4.3.2 成纤维细胞生长因子
  • 2.5 IGF-Ⅰ的临床应用
  • 第二部分 试验研究
  • 第3章 奶牛血浆胰岛素样生长因子-Ⅰ的测定及其与骨代谢相关因子的关系
  • 3.1 研究目的和意义
  • 3.2 材料和方法
  • 3.2.1 实验设计
  • 3.2.2 样品采集及处理
  • 3.2.3 指标的测定
  • 3.2.4 数据分析
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 日粮组成及钙磷代谢紊乱疾病的临床调查结果
  • 3.3.2 奶牛不同泌乳阶段血浆Ca、P、IGF-Ⅰ、ALP、PTH及CT水平的变化
  • 3.3.3 不同年龄奶牛血浆Ca、P、IGF-Ⅰ、ALP、PTH及CT水平的变化
  • 3.3.4 骨代谢病患牛与健康奶牛血浆Ca、P、IGF-Ⅰ、ALP、PTH及CT水平的比较
  • 3.3.5 奶牛血清IGF-Ⅰ水平与P、IGF-Ⅰ、ALP、PTH及CT的相关性
  • 3.4 讨论
  • 3.4.1 奶牛血浆Ca、P水平与年龄、妊娠的关系
  • 3.4.2 IGF-Ⅰ与奶牛骨代谢性疾病的关系
  • 3.5 小结
  • 第4章 奶牛成骨细胞的体外培养、鉴定及生物特性研究
  • 4.1 研究目的和意义
  • 4.2 材料和方法
  • 4.2.1 主要试剂和仪器
  • 4.2.2 细胞的分离与培养
  • 4.2.3 细胞的传代
  • 4.2.4 奶牛成骨细胞的鉴定
  • 4.2.4.1 形态学观察
  • 4.2.4.2 改良钙-钴法染色
  • 4.2.4.3 ALP活性测定
  • 4.2.4.4 OC mRNA检测
  • 4.2.4.5 OC蛋白检测
  • 4.2.5 奶牛成骨细胞的生物特性
  • 4.2.5.1 生长曲线的绘制
  • 4.2.5.2 钙化结节染色
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 细胞形态观察
  • 4.3.2 ALP的表达
  • 4.3.3 RT-PCR扩增OC基因
  • 4.3.4 ALP活性及OC蛋白水平的测定
  • 4.3.5 奶牛成骨细胞增殖曲线
  • 4.3.6 钙化结节染色
  • 4.4 讨论
  • 4.4.1 奶牛成骨细胞的体外分离培养
  • 4.4.2 奶牛成骨细胞特征性鉴定
  • 4.4.3 奶牛成骨细胞生物特性
  • 4.5 小结
  • 第5章 胰岛素样生长因子-Ⅰ对奶牛成骨细胞增殖、分化、矿化及重建的影响
  • 5.1 研究目的和意义
  • 5.2 材料和方法
  • 5.2.1 主要试剂和仪器
  • 5.2.2 细胞的培养
  • 5.2.3 奶牛成骨细胞的鉴定
  • 5.2.4 MTT法检测细胞增殖效应
  • 5.2.5 AAS法检测细胞基质钙含量
  • 5.2.6 钙结节数量检测
  • 5.2.7 ALP及OC活性测定
  • 5.2.8 半定量RT-PCR试验
  • 5.2.8.1 IGF-Ⅰ干预试验
  • 5.2.8.2 细胞总RNA的提取
  • 5.2.8.3 反转录（RT）
  • 5.2.8.4 引物设计
  • 5.2.8.5 PCR扩增
  • 5.2.8.6 凝胶图像分析
  • 5.2.9 OPG蛋白的测定
  • 5.2.10 数据分析
  • 5.3 结果
  • 5.3.1 奶牛成骨细胞特征性鉴定
  • 5.3.2 IGF-Ⅰ对奶牛成骨细胞增殖的影响
  • 5.3.3 IGF-Ⅰ对奶牛成骨细胞基质Ca、ALP、OC水平及钙化结节数量的影响
  • 5.3.4 循环数及模板量对PCR产物的影响
  • 5.3.5 IGF-Ⅰ对奶牛成骨细胞骨代谢相关因子mRNA表达的影响
  • 5.3.6 IGF-Ⅰ对奶牛成骨细胞OPG蛋白分泌的影响
  • 5.4 讨论
  • 5.4.1 IGF-Ⅰ对奶牛成骨细胞增殖的影响
  • 5.4.2 IGF-Ⅰ对奶牛成骨细胞分化及矿化的影响
  • 5.4.3 IGF-Ⅰ对奶牛成骨细胞重建的影响
  • 5.5 小结
  • 第6章 IGF-Ⅰ抑制血清饥饿诱导的奶牛成骨细胞凋亡
  • 6.1 研究背景
  • 6.2 材料与方法
  • 6.2.1 主要仪器及试剂
  • 6.2.2 细胞培养
  • 6.2.3 荧光染色
  • 6.2.4 琼脂糖凝胶电泳
  • 6.2.5 流式细胞仪分析
  • 6.2.6 细胞存活率检测
  • 6.2.7 Caspase 3活性检测
  • 6.2.7.1 pNA标准曲线的绘制
  • 6.2.7.2 样品caspase-3活性的测定
  • 6.2.7.3 样品蛋白浓度的测定
  • 6.2.8 数据分析
  • 6.3 结果
  • 6.3.1 荧光显微镜观察细胞凋亡
  • 6.3.2 细胞凋亡DNA断裂条带检测
  • 6.3.3 MTT法检测细胞存活率
  • 6.3.4 流失细胞术分析细胞周期及凋亡率
  • 6.3.5 凋亡蛋白caspasc-3的检测结果
  • 6.4 讨论
  • 6.4.1 血清饥饿诱导奶牛成骨细胞凋亡
  • 6.4.2 IGF-Ⅰ抑制由血清饥饿诱导的奶牛成骨细胞凋亡
  • 6.5 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

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