小豆蔻明基于mTOR信号通路抑制Lewis肺癌生长与转移的研究

论文摘要

1研究背景及目的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）参与肿瘤转移,]mTOR的异常激活促使肿瘤向周边及其远处器官组织转移。细胞粘附能力的下降是肿瘤转移过程的开端,E-钙粘蛋白（E-cadherin）为粘附分子中重要成员之一,主要维持上皮细胞形态,减少细胞分离。而它的表达下降或缺失,导致细胞易分散并向外侵袭,最终脱离原发灶。Snail是一种锌指蛋白转录因子,可与E-cadherin启动子结合,从而降低细胞内E-cadherin水平。mTOR活化促使下游靶点p70S6K激酶1（p70 ribosomal S6 kinase, p70S6K1）和真核细胞起始转录因子4E结合蛋白1（4E-binding protein-1,4EBP1）磷酸化,从而启动蛋白翻译过程,促进肿瘤细胞转移。mTOR/p70S6K能够增加Snail因子水平,引起细胞内E-cadherin表达下降,细胞间粘附能力减少。已有学者研究靶向抑制mTOR的RAP及其衍生物防治肿瘤转移,但存在免疫抑制、高胆固醇、肝脏损害及非感染性肺炎等潜在不良反应,因此寻找作用mTOR且副作用小的新型药物具有重要的临床意义。我室前期实验证实黄酮类单体小豆蔻明（cardamonin, CAR）能有效的抑制磷脂酸（phosphatidic acid, PA）诱导的人脐动脉平滑肌细胞（Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cells, HUASMCs）的增殖,可能通过靶向作用mTOR,抑制信号通路相关蛋白的表达。并证实CAR可抑制人类非小细胞肺癌A549细胞的异常增殖,进一步探寻发现,作用机制可能为抑制mTOR,阻断其信号通路转导,减少下游底物S6K1的磷酸化。本课题主要CAR对体内外小鼠Lewis肿瘤生长、转移的作用并探讨其作用机制。2方法2.1细胞培养Lewis培养于含10%胎牛血清、青霉素100U·mL-1、链霉素100μg·mL-1的高糖DMEM培养基,常规培养于37℃、5%CO2培养箱中,细胞单层贴壁生长,至70%-80%时胰蛋白酶消化传代。2.2实验分组与设计体外研究：细胞传代后,分别设立细胞对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、RAP组、CAR不同剂量组；另外PA刺激后,分别给予RAP和CAR不同剂量组。加入药物的最终浓度分别为PA（10-4 mol·L-1）,RAP（10-7mol·L-1）,CAR （10-4、3×10-5、10-5、10-6、10-7 mol·L-1）。在体研究：无血清培养基重悬Lewis细胞至1×107个/mL,取0.2 mL接种于C57BL/6小鼠前肢腋下,共48只。随机分为6组（n=8）,分别为①模型组：给予正常生理盐水；②阳性对照组：给予雷帕霉素（Rapamycin,RAP）1.12mg/kg；③溶剂对照组（VdH20: V吐温80: V无水乙醇=72:10:18）；④CAR高剂量组：10.5mg/kg;⑤CAR中剂量组：7mg/kg;⑥CAR低剂量组：3.5mg/kg。腹腔注射,1次/天,连续给药40天,第41天处死小鼠,分离瘤块称重,计算抑瘤率。取小鼠完整的肺部,称重并观察双肺表面转移结节,计算肺表面结节转移抑制率。2.3检测指标2.3.1细胞增殖：药物处理48 h后,MTT（λ=490nm）法测定Lewis细胞增殖；2.3.2体外细胞粘附、侵袭、迁移能力：药物处理30、60、90 min后,MTT（λ= 490nm）检测细胞与基质粘附能力；利用Matrigel胶模拟体内细胞外基质,药物处理40 h后固定染色,显微镜下观察小室下表面穿过的细胞数,检测细胞的侵袭能力；药物处理24、48 h后,显微镜下观察各组划痕愈合情况,检测细胞迁移能力。2.3.3肿瘤形态学：每天测量小鼠的体重与瘤体的体积（V=0.5×L×D2,L;长度,D：宽度,）；抑瘤率（%）=（1-各给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）×100%;转移抑制率（%）=（1-各给药组平均转移灶数/对照组平均转移灶数）×100%。光学显微镜观察药物对肿瘤肺转移的组织学影响。2.3.4蛋白表达量：取小鼠瘤块,利用细胞裂解液提取瘤体中总蛋白,运用Westernblotting技术,β-actin抗体为对照,测定mTOR、p70S6K1、P-mTOR、P-p70S6K1、E-cadherin、Snail蛋白表达。3结果3.1 CAR对Lewis细胞增殖的影响①CAR各剂量组均能够有效抑制正常Lewis肺癌的增殖（吸光值分别为0.423±0.0089 vs 0.406±0.0049、0.361±0.0039、0.277±0.0041、0.208±0.0062、0.127±0.0059；P<0.01）,并存在剂量依赖性；②CAR各剂量组也能够剂量依赖性的抑制PA刺激下的Lewis肺癌增殖（吸光值分别为0.549±0.0112 vs 0.390±0.0078、0.318±0.0068、0.242±0.005、0.152±0.0053;P<0.01）。3.2 CAR对Lewis肺癌转移能力的影响：CAR处理后的30、60、90 min均能够降低Lewis肺癌细胞粘附能力,90 min处CAR作用达到最佳；同时也降低细胞侵袭和运动迁移的能力。3.3 CAR对在体肿瘤生长及转移的影响①CAR能够有效抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤的生长,具有剂量依赖性,抑瘤率分别为24.6%、41.2%和68.6%（P<0.01）；②CAR也能够剂量依赖性的抑制Lewis肺癌小鼠的肺转移,抑制率别为37.8%、51.6%和65.7%（P<0.01）；③RAP和不同剂量的CAR能够抑制体内mTOR、p70S6K1的磷酸化表达（mTOR分别为0.0893±0.0083；0.3758±0.0079、0.1003±0.0073、0.0102±0.0058,p70s6k1分别为0.1874±0.0048；0.5226±0.0064、0.1985±0.0032、0.0213±0.0076）,减少Snail蛋白水平（分别为0.1726±0.0053；0.4273±0.0048、0.1837±0.0073、0.0534±0.0042）,增加E-cadherin表达（分别为0.4802±0.0072；0.1924±0.0048、0.4521±0.0062、0.6724±0.0073）（P<0.01）：④RAP和CAR对体内mTOR、p70S6K1的总蛋白表达无显著影响。4结论1.CAR体外能够抑制Lewis细胞的增殖,以及Lewis细胞粘附、侵袭和运动迁移；2.CAR剂量依赖性的抑制Lewis肺癌小鼠体内肿瘤的生长和肺部转移；3.CAR体内抗肿瘤作用可能与阻碍mTOR通路,降低mTOR活性密切相关,且,抑制下游p70S6K1和Snail的蛋白表达,增加E-cadherin水平。

论文目录

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• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 小豆蔻明对Lewis肺癌细胞增殖和转移的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 小豆蔻明对Lewis肺癌小鼠体内肿瘤生长和转移的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
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