弓形虫SAG1、MIC3单基因及SAG1-MIC3融合基因真核表达载体的构建与鉴定

论文摘要

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生的机会致病性虫,呈世界性分布,可引起人兽共患弓形虫病,由法国学者Nicolle及Manceaux于1908年发现。虫体呈弓形,故命名为弓形虫。其发育全过程一般包括5种不同形态的阶段,分别是滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊。其中滋养体、包囊、和卵囊与传播和致病有关。人群感染虽多为隐性感染,但在免疫缺陷病人或孕妇,弓形虫感染能导致严重的并发症。有趣的是弓形虫还能影响人的性情,有学者指出:与没有感染弓形虫的人相比,感染弓形虫的人的智商要偏低,统计数据也表明弓形虫与精神分裂症有着某种联系。家畜对弓形虫易感,由弓形虫感染引起的家畜的流产、早产、死产给畜牧业生产造成严重的经济损失。猫、狗等宠物也易感染弓形虫,是人类感染弓形虫的重要传染源。鉴于弓形虫病对于人和家畜的破坏性作用所造成的经济损失,研制出具有免疫保护的疫苗迫在眉睫。弓形虫疫苗从死疫苗到减毒活疫苗,从直接提取虫体的表面抗原到用基因工程技术提纯单价亚单位疫苗,再到现在针对生活史不同阶段、联合多种抗原组合的复合多价疫苗。速殖子是弓形虫主要的致病阶段,其表膜是宿主免疫防御系统识别和杀伤虫体的主要作用部位,膜抗原对于疫苗防治方面有着重要意义。弓形虫表膜p30抗原是迄今为止弓形虫抗原研究最多的一种抗原,其基因代号为SAG1,P30蛋白是一种期特异性蛋白,只存在于弓形虫速殖子期,而在缓殖子期、子孢子期不表达。P30蛋白约占虫体蛋白的3%～5%,但诱导机体产生的抗体可占抗体总量的50%。在急慢性病人血清中均能检测出P30抗体。p30蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体都能限制人成纤维细胞的弓形虫感染,说明抗体有相当的保护作用。P30抗原特异性的CD4+T细胞能直接杀伤细胞外弓形虫,对弓形虫感染的腹腔巨噬细胞亦有细胞毒性。弓形虫对宿主细胞的粘附和入侵过程中伴随着微线体内容物的释放,其中MIC3基因编码的MIC3蛋白是弓形虫微线体内容物的一种,在弓形虫入侵宿主过程中起到连接弓形虫和宿主的桥梁的作用。MIC3是一种大小为90KD蛋白,参与虫体与宿主细胞间的黏附过程,且在弓形虫速殖子、缓殖子和子孢子三个感染阶段都有表达。MIC3在早期能够诱导小鼠和人分泌高效价的IgG抗体以及IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10等细胞因子,使机体产生高强度的体液免疫和细胞免疫应答,作为疫苗候选分子具有巨大的潜力。本实验根据已发表的弓形虫SAG1及MIC3基因序列,在保证其开放读码框架正确的前提下,自行设计合成引物,在引物的5’末端分别加上适当的限制性内切酶酶切位点,PCR扩增得到SAG1及MIC3基因。鉴定基因片段后通过克隆技术,构建真核表达质粒pcDNA3.1-SAG1-MIC3、pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-MIC3。并对氨苄筛选的重组入外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定。采用脂质体法将重组载体转染Hela细胞,转染后Trizol提取细胞总RNA,以Oligo（dT）为引物逆转录生成cDNA第一条链。管家基因β-actin PCR验证逆转录,SAG1-MIC3、SAG1、MIC3基因片段PCR验证转基因的表达。以验证真核表达载体pcDNA3.1能否在哺乳动物细胞中表达转录复合基因SAG1-MIC3及单基因SAG1、MIC3。本实验显示三个真核表达质粒成功构建,且载体携带的SAG1-MIC3融合基因、SAG1、MIC3单基因在Hela细胞中转录生成mRNA。从而为今后的动物实验奠定了基础,为弓形虫复合多价亚单位疫苗的研制提供了候选成份。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 复合基因真核表达质粒及单基因真核表达质粒的构建与鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 弓形虫表面抗原SAG1和微粒体蛋白MIC3单基因及复合基因真核表达质粒在Hela细胞中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 发表学术论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表