GDNF转染的神经干细胞移植到PLGA管修复大鼠面神经缺损的研究

论文摘要

第一部分GDNF基因慢病毒载体的构建及病毒的包装目的:构建携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因的慢病毒载体,为基因治疗提供良好的载体。材料和方法:采用PCR扩增,限制性内切酶酶切,T4DNA连接酶连接等方法,将GDNF插入慢病毒主体载体pGC-FU,构建成携带EGFP和GDNF基因的重组慢病毒载体（lenti-GDNF-EGFP）,PCR和测序鉴定阳性克隆。构建成功的慢病毒三质粒系统通过Lipofectamine 2000转染于人胚肾细胞系（293T）,测定病毒滴度。结果:成功构建出表达EGFP和GDNF基因的慢病毒载体,通过测序及PCR鉴定,产出表达GDNF基因的慢病毒,病毒滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建携带EGFP和GDNF基因的慢病毒载体,为基因治疗提供高效稳定的平台。第二部分神经干细胞的培养、转染及复合PLGA管的体外实验研究目的:利用表达GDNF基因的慢病毒转染原代培养的神经干细胞（NSCs）并移植到PLGA管,构建具有生物活性的人工神经导管,为下一步的动物实验提供营养支持。材料和方法:利用胚胎SD大鼠大脑海马组织取材培养原代NSCs,采用免疫细胞化学方法鉴定细胞,并通过慢病毒载体把GDNF基因转入NSCs和雪旺氏细胞（SCs）,流式细胞仪检测转染5天后和三月后的效率,Western Blotting鉴定转染后细胞中GDNF的表达,ELISA鉴定转染后细胞分泌GDNF的量,转染后的NSCs和SCs移植到PLGA神经导管,场扫描电镜观察细胞形态变化,并在NSCs移植到体内前利用Lipofectamine2000把纳米铁转入细胞。结果:成功培养出NSCs,并成功转入GDNF基因,转染效率为77.7%,三月后仍有73.7%。Western Blotting的结果表明GDNF基因成功在细胞内表达,ELISA表明转染后细胞外分泌GDNF的量随着时间的推移会越高,与对照组有显著差异（P＜0.05）。转染后的NSCs与PLGA管复合,构建出有生物活性的人工神经导管。结论:通过慢病毒介导GDNF基因能高效转入NSCs,与PLGA管共同构建成具有生物活性的人工神经导管。第三部分转基因神经干细胞移植到神经导管修复大鼠面神经缺损的研究目的:通过移植高表达GDNF的NSCs到可降解的PLGA神经导管来修复大鼠面神经的缺损。材料和方法:96只SD大鼠随机分成4组,进行右侧面神经损伤手术,分别移植（A）空的PLGA导管;（B）含有EGFP标记的NSCs+PLGA导管;（C）转染GDNF的NSCs+PLGA导管;（D）转染GDNF的SCs+PLGA导管;术后2、4、8、12周分别通过电生理检测、免疫组化、轴突形态学检测等方法来评估面神经的再生。体内通过Realtime PCR鉴定移植后GDNF基因的表达,通过铁染色和体内荧光鉴定细胞为外来移植细胞。结果:转基因的NSCs在体内持续高表达GDNF,该组12周时神经动作电位的振幅,轴突的面积和计数,髓鞘的厚度都高于NSCs和单纯导管组（p=0.000＜0.05）;轴突的面积和计数也高于转基因SCs组但无统计意义（p=0.071＞0.05）。体内铁染色和体内荧光结果表明细胞为外来的移植细胞。结论:转基因的NSCs和PLGA神经导管的共移植在修复面神经缺损方面优势明显,可促进面神经的再生。

论文目录

• 主要英文名词及缩写
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 GDNF基因慢病毒载体的构建及病毒的包装
• 前言
• 实验一 目的基因GDNF慢病毒载体的构建
• 材料和方法
• 结果
• 实验二 目的基因GDNF过表达慢病毒的包装
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 神经干细胞的培养、转染及复合PLGA管的体外实验研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 转基因神经干细胞移植到神经导管修复大鼠面神经缺损的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 博士阶段发表的文章
• 致谢