DMT1在MPP+和6-OHDA导致的MES23.5细胞内铁聚积中的作用研究

论文摘要

帕金森病（parkinson’s disease,PD）是继阿尔茨海默病之后的第二大神经系统退行性疾病。在我国患帕金森病的病人已达172万、55岁以上的人群帕金森病的患病率接近1%。随着老龄化社会的到来,PD已成为一个沉重的话题。由于该病的确切病因和发病机制尚不清楚,目前只能是对症治疗,无法从根本上治疗PD并延缓其进展,因此,深入探讨PD的发病机制成为医学界迫在眉睫的话题。铁在PD的发病过程中起着关键的作用,过量的游离铁,特别是Fe2+可以通过Fenton反应形成羟自由基（hydroxyl radical,OH·）,OH·通过损伤蛋白质、核酸、和含有大量未饱和脂肪酸的细胞膜,最终导致细胞死亡。目前已有大量的证据表明凋亡也参与了PD的发病过程。在PD的发病过程中,黑质（substantia nigra,SN）内过多的铁的异常沉积可能是导致多巴胺神经元死亡的关键因素。但是,是什么原因导致SN内铁聚集目前还不清楚。由于经典的转铁蛋白/转铁蛋白受体途径在PD中没有改变,因此,我们拟研究新发现的铁转运蛋白,二价金属离子转运蛋白1（divalent metal transporter 1,DMT1）在PD SN铁聚积中的作用。本实验应用两种经典的神经毒性药物1-甲基-4苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenyl-pyridium,MPP+）和6羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）,应用Western blots、实时荧光定量PCR、流式细胞术技术、激光共聚焦显微镜等多种综合技术,观察其对DMT1的表达以及细胞摄铁能力的影响,并深入讨论其机制。结果如下:1.MPP+（5μmol/L）处理MES23.5细胞24h,可以增加细胞对Fe2+的摄取,与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.01）,细胞的线粒体跨膜电位（mitochondrialtransmembrane potential,△ψm）降低,细胞内活性氧物质（reactive oxide species,ROS）生成增加,caspase-3激活,细胞核发生固缩。上述改变可以被DFO所阻断。2.MPP+（5μmol/L）处理MES23.5细胞24h,DMT1（-IRE）的蛋白表达增加,其mRNA的表达也增高,但DMT1（+IRE）的表达未观察到变化。3.上述细胞铁调节蛋白2（iron regulatory protein 2,IRP2）mRNA的表达水平下降,而IRP1 mRNA的表达水平无变化。4.6-OHDA（μmol/L）处理MES23.5细胞24h,可以增加细胞对Fe2+的摄取,与对照组相比差别有统计学意义（P＜0.01）,细胞的△ψm降低,细胞内ROS增加,caspase-3激活,细胞核发生固缩。上述改变可以被DFO所阻断。5.6-OHDA（μmol/L）处理MES23.5细胞24h,DMT1（+IRE）蛋白表达增高,其mRNA表达也增高,但DMT1（-IRE）的表达未观察到变化。6.6-OHDA（μmol/L）处理的MES23.5细胞IRP1和IRP2mRNA及蛋白的表达均上调。7.成功构建携带干涉IRP1和IRP2干涉序列的质粒,pSilencer1.0U6-IRP1-1、pSilencer1.0U6-IRP1-2、pSilencer1.0U6-IRP2-1、pSilencer1.0U6-IRP2-2。经RT-PCR筛选出pSilencer1.0U6-IRP1-1和pSilencer1.0U6-IRP2-1以质粒和脂质体质量/体积比为1:5转染细胞48h时,对IRP1和IRP2的干涉效果较好。Western Blots检测pSilencer1.0U6-IRP1-1和pSilencer1.0U6-IRP2-1的干涉效率分别为71%和65%（P＜0.01）。8.干涉IRP1或IRP2后,DMT1（+IRE）蛋白和mRNA表达水平与空载体对照组相比都明显下调。10μmol/L 6-OHDA处理24 h后,DMT1（+IRE）蛋白和mRNA表达水平仍有升高,但升高的幅度明显减轻。这说明两种IRP都参与了在6-OHDA导致的DMT1（+IRE）的表达上调。上述结果表明:MPP+和6-OHDA处理的MES23.5细胞,均可导致细胞对Fe2+的摄入增强。细胞内增多的Fe2+可以通过降低细胞△ψm,增加ROS的产生,激活caspase-3,导致细胞DNA断裂,从而使细胞发生凋亡。铁离子螯合剂去铁胺（deferoxamine mesylate,DFO）可完全阻断此作用。MPP+诱导的细胞摄铁功能的增强是通过IRE/IRP非依赖性的途径上调DMT1（-IRE）来实现的。而6-OHDA诱导的细胞摄铁功能的增强是通过IRE/IRP依赖的转录后翻译调节上调DMT1（+IRE）实现。两种神经毒性药物对DMT1的调节机制不同,但均可通过上调DMT1的表达,使细胞的摄铁功能增强,进而导致细胞的凋亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• +诱导的MES23.5细胞的凋亡'>第一章 DMT1的表达上调参与了MPP⁺诱导的MES23.5细胞的凋亡
• 摘要
• Abstract
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 MTT方法检测细胞存活率
• 2.3 MES23.5细胞摄铁功能检测
• 2.4 细胞线粒体跨膜电位的检测
• 2.5 细胞内活性氧物质检测
• 2.6 活化caspase-3的含量检测
• 2.7 细胞核形态改变的检测
• 2.8 DMT1蛋白表达检测
• 2.9 DMT1mRNA的表达检测
• 2.10 细胞IRP1、IRP2 mRNA表达检测
• 3 结果
• +对MES23.5细胞活力的影响'>3.1 MPP⁺对MES23.5细胞活力的影响
• +对MES23.5细胞摄铁的影响。'>3.2 MPP⁺对MES23.5细胞摄铁的影响。
• +预处理后铁孵育降低细胞△Ψm'>3.3 MPP⁺预处理后铁孵育降低细胞△Ψm
• +预处理后铁孵育诱导caspase-3的激活'>3.4 MPP⁺预处理后铁孵育诱导caspase-3的激活
• +预处理后铁孵育诱导MES23.5细胞DNA的片段化'>3.5 MPP⁺预处理后铁孵育诱导MES23.5细胞DNA的片段化
• +预处理上调DMT1（-IRE）的表达,对DMT1（-IRE）没有影响'>3.6 MPP⁺预处理上调DMT1（-IRE）的表达,对DMT1（-IRE）没有影响
• 3.7 DMT1的表达上调并不依赖于IRE/IRP系统
• 4.讨论
• 第二章 DMT1在6-OHDA导致的MES23.5细胞内铁聚积中的作用研究
• 摘要
• Abstract
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 2.1 6-OHDA处理后DMT1和IRPs蛋白和mRNA的表达检测
• 2.2 干涉技术干涉IRP1和IRP2基因
• 2.3 IRP1和IRP2干涉后IRPs和DMT1mRNA和蛋白的表达检测
• 3 结果
• 3.1 6-OHDA预处理增加MES23.5细胞的摄铁功能
• 3.2 6-OHDA预处理后铁孵育降低细胞△Ψm并增加ROS的升成
• 3.3 6-OHDA预处理铁孵育诱导的caspase-3的激活
• 3.4 6-OHDA预处理铁孵育诱导MES23.5细胞内DNA的片段化
• 3.5 6-OHDA预处理导致DMT1（+IRE）蛋白和mRNA表达增高
• 3.6 IRPs参与了6-OHDA对DMT1（+IRE）的调节
• 3.7 IRP1和IRP2 siRNA表达载体的鉴定和序列测定
• 3.8 RT-PCR检测不同干涉片段对IRPs的干扰效果
• 3.9 IRP1和IRP2的干涉效果检测
• 3.10 IRPs干涉后6-OHDA对MES23.5细胞内DMT1（+IRE）mRNA和蛋白表达的影响
• 4.讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 附录（缩略词表）
• 攻读硕士期间的研究成果
• 致谢