大鼠睾丸移植模型的细胞外信号调节激酶表达研究

论文摘要

研究背景世界卫生组织（WHO）规定,夫妇同居1年以上,未采用任何避孕措施,由于男方因素造成女方不孕者,称为男性不育。据统计,世界发达国家5%～8%的育龄夫妇可能存在不育问题,而发展中国家的某些地区可高达30%。在我国,不育症发病率也在逐步上升,北京协和医院男科将1980～1990年问诊治的万余例男性不育者进行了粗略统计,发现就诊人数后5年是前5年的2倍多。男性生殖健康状况令人担忧。引起男性不育的因素有很多。睾丸移植是治疗无睾症和双侧小睾症伴严重低睾酮血症的可选择的重要方法之一。目前,睾丸移植的临床研究仅限于经典的器官移植。而同种异体睾丸移植由于术后生精功能恢复不良等原因,发展受到很大限制。为此,众多研究尝试通过睾丸移植动物模型探索移植睾丸损伤的机制,寻找保护移植睾丸生精功能的方法。睾丸移植动物模型早年采用大型动物如犬类等,获得一定效果。但由于大型动物费用昂贵,麻醉要求高及难于饲养管理等因素,推广受到限制。1971年Lee等建立大鼠睾丸移植模型,为睾丸移植研究创造了有利条件。但由于小型动物血管吻合难度高,发展缓慢。2003年,谭付清等利用cuff管法成功进行大鼠异体睾丸移植,进一步推动了睾丸移植研究发展。但由于大鼠睾丸血管变异较多,因此,应区别对待方有助于该模型的进一步推广应用。我们通过100例研究,共发现大鼠四种左侧睾丸血管走向类型,第一种:左睾丸动脉来自腹主动脉,左睾丸精索静脉汇入左髂总静脉者,即谭付清等报道的类型,约占63%;第二种:左睾丸动脉来自左肾动脉,而左睾丸精索静脉汇入左髂总静脉者,约占13%;第三种:左睾丸动脉来自左肾动脉,而左静脉汇入左肾静脉者,约占14%;第四种:左睾丸动脉汇入腹主动脉,而左睾丸精索静脉汇入左肾静脉者,约占10%。因此有必要针对不同左睾丸血管走向类型对手术方法做相应的调整。在移植睾丸损伤机制的研究领域中,缺血再灌注损伤备受关注。有研究发现ERK（细胞外信号调节激酶）在缺血再灌注模型中被激活并介导靶器官组织的损伤。但也有研究持不同观点。睾丸移植是否激活ERK表达,ERK与移植睾丸损伤的关系如何,目前仍不清楚。我们的研究应用谭付清等报道的方法建立大鼠睾丸原位异体睾丸移植模型,并进行改良,扩大原模型的适用范围;并在此基础上,研究大鼠睾丸移植模型中ERK1（细胞外信号调节激酶1）、ERK2（细胞外信号调节激酶2）、pERK1（磷酸化细胞外信号调节激酶1）和pERK2（磷酸化细胞外信号调节激酶2）表达水平变化,探讨ERK表达水平与移植睾丸损伤的关系,同时观察MEK1/2（细胞外信号调节激酶的激酶1/2）抑制剂U0126(C18H16N6S2)对ERK1、ERK2、pERK1和pERK2表达水平的影响,及其在短期内（一周及一个月）对移植睾丸的保护作用。第一部分大鼠原位异体睾丸移植模型的建立与改良目的采用2003年谭付清等报道的大鼠原位异体睾丸移植模型进行大鼠睾丸移植,并对此模型进行改良,扩大该模型应用范围,为睾丸移植相关基础研究提供稳定的平台。方法实验动物为230～250g体重Lewis大鼠。根据解剖发现的四种不同的大鼠左睾丸血管走向类型,设计相应的供体血管切取方法及移植时血管吻合方法,建立并改良大鼠睾丸移植模型。开放血流后移植睾丸恢复正常颜色和输精管末端有活动性出血为移植成功的判断标志。比较四种手术方法间平均手术时间、平均冷缺血时间、平均血管吻合时间、即时血流通畅率的差异,及术后一周移植睾丸血供和受体左下肢血供情况。结果1.四种手术方法即时血流通畅率均为100%,组间无差异。2.四种手术方法在平均总手术时间、平均冷缺血时间及平均血管吻合时间有所差异。3.四种手术方法术后1周解剖时发现血供情况均良好,睾丸动脉搏动正常,睾丸色泽红;各组左下肢体温同右下肢,活动无障碍,提示血供良好。结论1.本部分成功建立大鼠原位异体睾丸移植模型并进行改良。2.四种手术方法间手术时间的差别不影响改良组的即时血流通畅率。3.结扎受体左髂总静脉不影响受体左下肢血液循环。4.切除受鼠一个肾脏,不影响睾丸移植模型的建立。第二部分睾丸移植对ERK1、ERK2、pERK1及pERK2表达水平的影响目的测定睾丸移植供睾ERK1、ERK2、pERK1及pERK2表达水平的变化,并分析其上述酶表达水平变化与供睾形态学损伤的关系。方法将实验大鼠分为4组:①正常对照组,②冷缺血组,③假手术组,和④睾丸移植组。Western-Blot法测定各组移植睾丸ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表达水平,光镜和电镜下观察组织学改变并计算平均睾丸活检评分（MTBS）。ERK1与ERK2表达灰度值和内参照表达灰度值的比值,作为ERK1与ERK2表达水平测定值;pERK1与pERK2表达灰度值和内参照表达灰度值的比值,作为pERK1与pERK2表达水平测定值;并分别计算pERK1/ERK1比值和pERK2/ERK2比值。比较各组ERK1、ERK2、pERK1、pERK2的表达水平及pERK1/ERK1比值和pERK2/ERK2比值的差异。结果1.正常对照组、冷缺血组和假手术组ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表达水平均无显著性差异。2.正常对照组、冷缺血组和假手术组移植睾丸光镜及电镜下形态近似,MTBS无明显差异。3.睾丸移植组ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表达水平均明显高于正常对照组,但pERK1/ERK1比值及pERK2/ERK2比值与正常对照组无明显差异。4.睾丸移植1组的形态学改变较正常对照组明显,MTBS低于正常对照组。结论1.一般手术操作及冷缺血过程不影响ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表达水平,对移植睾丸不产生显著形态学损伤。2.睾丸移植缺血再灌注过程分别激活ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表达,并且成比例增长,故pERK1/ERK1的比值及pERK2/ERK2的比值并没有增加。3.睾丸移植缺血再灌注过程造成的形态学损伤,与ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表达水平呈正相关。第三部分MEK抑制剂U0126在短期内对移植睾丸生精功能的保护作用目的研究睾丸移植后短期内,移植睾丸生精功能变化,及U0126预处理在短期内对移植睾丸生精功能的影响。方法设立二组:睾丸移植组、睾丸移植U0126预处理组:手术组各分三个时点进行观测:移植后30min、一周及一个月。Western-Blot法测定30min时点移植睾丸ERK1、ERK2、pERK1及pERK2的表达水平。应用放射免疫试剂盒检测受体血清T、FSH和LH水平,光镜及电镜下观察移植睾丸形态学变化并进行Johnsen评分,测量并计算睾丸移植前后体积缩小百分比。比较各组实验结果之间的差异。结果1.术后一个月内,睾丸移植组睾丸体积逐渐缩小,形态学损伤逐渐加重,MTBS及血清睾酮水平逐渐下降。2.U0126预处理组ERK1、ERK2表达水平与睾丸移植组无显著差异,pERK1、pERK2表达水平显著低于睾丸移植组,且pERK2下降更显著。3.移植后30min,U0126预处理组形态学改变显著轻于睾丸移植组,MTBS高于睾丸移植组。4.术后一周,U0126预处理组大鼠血清T、LH、FSH水平较睾丸移植组均显著升高,但较正常对照组均无显著性差异;移植睾丸形态学改变较睾丸移植组轻;MTBS较睾丸移植组高;睾丸体积缩小百分比较睾丸移植组低。5.术后一个月,U0126预处理组仅睾丸体积缩小百分比低于睾丸移植组,其余结果均与睾丸移植组无差异。结论1移植睾丸在术后一个月内,随时间延长,形态学损伤逐渐加重,生精功能逐渐下降。2 U0126不影响ERK1与ERK2的合成,但能明显抑制ERK1与ERK2的磷酸化,且对ERK2磷酸化的抑制效果强于ERK1。3 U0126预处理通过抑制ERK1及ERK2磷酸化,在术后一周内显著减轻移植睾丸的形态学损伤,并维持生殖激素水平,保护生精功能。4 U0126预处理在术后一个月仅能延缓移植睾丸的萎缩,而无其他保护作用。

论文目录

• 一 缩略语
• 二 中文摘要
• 三 英文摘要
• 四 论文正文
• 大鼠睾丸移植模型的细胞外信号调节激酶表达研究
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 大鼠原位异体睾丸移植模型的建立与改良
• （一）引言
• （二）材料和方法
• （三）结果
• （四）讨论
• （五）结论
• （六）参考文献
• 第二部分 睾丸移植对ERK1、ERK2、pERK1及pERK2表达水平的影响
• （一）引言
• （二）材料和方法
• （三）结果
• （四）讨论
• （五）结论
• （六）参考文献
• 第三部分 MEK抑制剂U0126在短期内对大鼠原位异体睾丸移植缺血再灌注损伤的保护作用
• （一）引言
• （二）材料和方法
• （三）结果
• （四）讨论
• （五）结论
• （六）参考文献
• 五 综述
• 六 附录
• 七 致谢