肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶在癌性恶液质中作用机制的研究

论文摘要

癌性恶液质（cancer cachexia,CC）是恶性肿瘤的特征之一。CC表现为厌食、贫血、蛋白质分解增加、瘦组织群丢失、机体消耗、进行性体重下降、消瘦甚至器官功能受损。其中肌肉等瘦组织群减少,肌肉进行性分解丢失是其最显著的特征,常使病人生活质量下降并导致病人对抗癌治疗的耐受性下降,并最终导致病人的死亡。对CC的治疗目前尚不理想,主要因为对其发生机制了解不够深入。研究表明癌性恶液质导致的骨骼肌蛋白分解最主要是通过ATP-泛素—蛋白酶体分解途径,而泛素蛋白连接酶（E3）是该途径激活的关键酶。有三种E3组分蛋白在肌肉中特异性表达:Atrogin-1、MuRF1和E3a-Ⅱ。国内外尚无有关E3与CC之间关系的成熟研究,因此深入研究E3在CC中的作用机制意义重大。本课题拟研究肌肉细胞特异性E3在CC发生机制中的作用,探讨其是否是CC理想干预靶点,以期将来用于临床治疗。课题第一部分,我们研究肌肉细胞特异性E3在恶性肿瘤患者肌肉中的表达情况,并与良性疾病患者进行比较,探讨E3表达上调的临床意义;第二部分,我们通过小鼠CC模型研究肌肉细胞特异性E3以及泛素—蛋白酶体分解系统其他组分在CC发生机制中的作用,从而进一步明确E3在ATP-泛素—蛋白酶体分解途径中的关键地位;第三部分,我们构建了肿瘤坏死因子a（tumor necrosisfactor-alpha,TNF a）诱导的肌肉细胞营养不良模型,并利用慢病毒感染体系构建含有E3（Atrogin-1）siRNA的重组慢病毒,研究通过RNAi技术将Atrogin-1基因沉默后对C2C12肌肉细胞营养不良的保护作用。我们发现,肌肉细胞特异性E3在恶性肿瘤患者肌肉中特异性高表达;CC小鼠模型能稳定建立,其肌肉中肌肉细胞特异性E3乃至ATP-泛素—蛋白酶体分解系统其他组分特异性高表达,与CC密切相关;TNF a能引起肌肉细胞营养不良,肌肉细胞特异性E3-Atrogin-1基因表达上调,将Atrogin-1基因沉默后能够避免TNF a引起的肌肉细胞营养不良。我们深入研究肌肉细胞特异性E3以及ATP-泛素—蛋白酶体分解系统其他组分在临床患者、CC小鼠模型骨骼肌中的表达情况,探讨其机制;我们首次采用慢病毒介导的核糖核酸干扰（RNA interference,RNAi）法对Atrogin-1基因进行沉默,成功避免了TNF a引起的肌肉细胞的营养不良,为进一步在临床上对CC进行特异性干预奠定基础。第一部分肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶在癌症患者肌肉中的表达及意义【目的】检测肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶（E3）在恶性肿瘤患者骨骼肌中的表达情况,研究其与恶性肿瘤患者营养不良之间的关系,探讨其在CC发生机制中的作用。【方法】采取21例消化道恶性肿瘤患者和23例良性疾病患者腹壁肌肉组织,采用实时荧光定量PCR（Real time PCR）法和Western Blot法分别测定病人肌肉中Atrogin-1、MuRF1基因mRNA和蛋白水平的表达,探讨其临床意义,并联系两组病人的术前营养状况进行统计分析。【结果】与良性疾病患者相比,恶性肿瘤患者肌肉中Atrogin-1mRNA、MuRF-1mRNA的表达显著增高（两者P值均＜0.05）;恶性肿瘤患者肌肉中Atrogin-1蛋白表达较良性疾病患者明显增强;恶性肿瘤病人术前存在明显营养不良,多项营养相关指标与良性疾病患者相比具有明显的差异（p＜0.05）。【结论】E3表达上调与营养不良、CC密切相关,E3表达上调在CC发生机制中起重要作用。第二部分肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶在癌性恶液质小鼠模型中的研究【目的】检测肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶（E3）以及ATP-泛素—蛋白酶体分解系统其他组分在小鼠CC模型骨骼肌中的表达,并探讨其在CC发生中作用机制。【方法】利用鼠结肠癌26细胞株（c26）接种BALB/c小鼠,建立CC模型,并设立对照组,观察小鼠每天体重、摄食量和肿瘤大小的变化,测量小鼠最终去瘤体重和腓肠肌重量,Real time PCR、western blot和免疫组化法测定小鼠腓肠肌中Atrogin-1、biuRF1在mRNA和蛋白水平表达,同时检测ubiquitin mRNA和E214KmRNA的表达情况。【结果】荷瘤组小鼠有明显恶液质现象。两组小鼠摄食量差异无统计学意义（P＞0.05）;荷瘤组去瘤体重和腓肠肌重量明显下降（P＜0.05）,荷瘤组E3（Atrogin-1和MuRF1）、ubiquitin和E214K(在mRNA水平较对照组表达明显增高（P＜0.01）,荷瘤组E3蛋白表达也明显升高。【结论】肌肉细胞特异性E3以及ATP-泛素—蛋白酶体分解途径其他组分在CC小鼠骨骼肌中高表达,与CC明显相关,提示该途径在CC骨骼肌消耗中起重要作用。第三部分Atrogin-1基因沉默对肌肉细胞营养不良保护作用的研究【目的】构建TNF a诱导的肌肉细胞营养不良模型,在此基础上研究将Atrogin-1基因沉默对小鼠成肌细胞（C2C12细胞）营养不良的保护作用,以确立Atrogin-1基因是否是恶液质治疗的理想靶点。【方法】C2C12细胞分化培养96h形成肌管,加入TNF a进行刺激,观察细胞形态的变化,Real time PCR和western blot法分别检测肌管中Atrogin-1mRNA和Atrogin-1蛋白表达。然后设计合成五对Atrogin-1基因siRNA靶序列及一对对照序列,退火形成双链DNA,产物先克隆到pBS-hU6-I载体获得启动子U6,然后克隆到慢病毒核心载体FG12中,重组FG12质粒与包装质粒pRSVREV、pMDLg/pRRE和pHCMV-G共同转染293T细胞,包装病毒,然后用它感染C2C12细胞,将感染后的细胞分化成肌管后,用TNF a进行刺激,观察细胞形态的变化,Real time PCR和western blot法分别检测肌管中Atrogin-1mRNA和Atrogin-1蛋白表达。【结果】成功构建了TNF a诱导的肌肉细胞营养不良模型,与正常培养组相比,TNF a诱导组肌管萎缩明显。重组慢病毒载体中含大小、序列正确的片段,能成功感染C2C12细胞,与对照组相比,RNAi干预组细胞Atrogin-1mRNA、Atrogin-1蛋白表达下调,肌管无明显萎缩。【结论】肌肉细胞营养不良模型可通过TNF a诱导成功构建,含Atrogin-1基因siRNA的重组慢病毒载体可以将Atrogin-1基因沉默,从而避免产生TNF a诱导的肌肉细胞营养不良,因此Atrogin-1基因是恶液质治疗的理想干预靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶在癌症患者肌肉中的表达及意义
• 研究背景
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶在癌性恶液质小鼠模型中的研究
• 研究背景
• 材料及方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 Atrogin-1基因沉默对肌肉细胞营养不良保护作用的研究
• 研究背景
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 创新点
• 参考文献
• 文献综述
• 主要中英文缩略词对照表
• 附件
• 致谢