不同基底松弛对内皮细胞形态、骨架及细胞内Rho蛋白分布的影响

论文摘要

细胞在体内所处的环境是极其复杂的,较为突出的是表现在血流动力学因素对哺乳动物心血管系统中的内皮细胞的生理学影响。机械拉伸与剪切力、正压力等构成了体内细胞复杂力学关系的重要因素,由于机械拉伸与细胞附着、铺展、迁移、增殖等行为的关系,及其存在的普遍性,使得细胞对其的响应成为一个非常值得探讨的问题。实验从细胞形态变化、骨架重排以及对Rho蛋白影响方面分析了细胞在不同的机械外力作用下产生的不同效应。①体外细胞基底拉伸加载装置的研制鉴于细胞在体内的受力方式,体外研究所使用的机械拉伸方式大多为周期性的拉伸和松弛,而随着对机械拉伸的细胞信号转导问题研究的深入,需要对大量细胞进行加载。为了满足实验需求,在借鉴国内外已有装置的基础上,研制了一种适于大面积细胞培养、拉伸,并可以控制时间、应变大小、方向、频率等的单轴双向细胞基底拉伸装置,装置整个结构由数据采集系统、函数发生器、步进电机驱动器、压力传感器、位移传感器、细胞加载主要元件五个部分组成。该装置为研究细胞对机械拉伸的响应提供了多种检测手段。②不同基底状态的松弛对细胞形态骨架的影响利用以上装置,对细胞基底膜施以静态松弛不同时间、加载松弛后不同时间以及完全静态对照处理,使用计算机图像处理软件分别对不同试验方式的细胞的变化进行了分析,结果表明:静态松弛后细胞面积明显缩小;加载松弛后细胞形态发生了较大变化,细胞长短径比值随松弛时间的增加而变小,细胞也逐渐铺展开来,细胞骨架（应力纤维）倾向垂直于主应变方向,细胞长轴与加载方向夹角（取小于900角）均在700-900,与对照组相比变化显著。③不同基底状态的松弛对Rho蛋白分布的影响利用以上装置,对细胞基底膜施以静态松弛不同时间与完全静态对照处理,试验首先考虑将EYFP-RBD质粒转入细胞,通过质粒荧光和二抗荧光双荧光标记观察Rho的分布,但实验后发现此种方法不完善,改用免疫荧光方法观察,结果显示:经过静态拉伸的细胞,在松弛10min时Rho蛋白的分布与完全静息状态的基本上没变化,主要在细胞质与膜上呈弥散分布,细胞核内仅有少量分布;而在松弛40min时Rho蛋白分布表现为在整个细胞内呈弥散分布,并且在核内有较强的集中分布;经过周期加载处理的细胞在松弛10min时则在细胞膜上较明显的集中分布。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 问题的提出及研究意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.3 研究内容和目的
• 1.4 研究方案
• 2 体外细胞基底拉伸加载装置的研制
• 2.1 引言
• 2.2 装置结构及原理
• 2.3 讨论
• 3 周期加载细胞基底后松弛对细胞的影响
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料、试剂和仪器设备
• 3.2.1 实验仪器与设备
• 3.2.2 实验材料、试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细胞复苏及培养
• 3.3.2 细胞的静态松弛与加载松弛实验
• 3.3.3 测量及处理方法
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 细胞形态及取向变化
• 3.4.2 细胞骨架的重排
• 3.5 讨论
• 4 周期加载细胞基底后松弛对 Rho 蛋白分布的影响
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料、试剂和仪器设备
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 主要试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 4.3.2 RBD 质粒的分离、纯化和鉴定
• 4.3.3 RBD 质粒转染及克隆细胞筛选
• 4.3.4 细胞的静态松弛实验
• 4.3.5 Rho 蛋白的分布测定
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 RBD 质粒转染及细胞筛选
• 4.4.2 细胞基底松弛对Rho 蛋白分布的影响
• 4.5 讨论
• 5 结论及展望
• 5.1 全文主要研究工作及主要结论
• 5.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录