农杆菌介导sbe Ⅱb基因RNA干涉片段转化玉米自交系的研究

论文摘要

玉米是重要的粮食、饲料与工业原料作物,长期以来,玉米优良基因型高效再生体系的建立一直是人们研究的热点。淀粉是玉米籽粒中最主要的成分,随着玉米淀粉在能源、化工和材料等工业上的广泛应用,改良玉米淀粉品质已成为近年来一个十分重要的目标。RNA干涉是一种重要的基因沉默方式,在植物基因功能和遗传改良研究中广泛应用。为进一步筛选和建立优良玉米自交系的再生和遗传转化体系,探讨RNAi技术在玉米淀粉品质改良中的应用效果,建立玉米RNAi的分子育种新方法。本文以玉米幼胚为外植体,较系统地研究了七个常规优良自交系的再生体系、农杆菌介导遗传转化体系,构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因的RNAi表达载体,开展农杆菌介导的玉米遗传转化,并对转化株进行了分子验证,获得了如下主要结果:1.选用了生产上广泛应用的7个玉米优良自交系,通过组织培养研究其再生情况,玉米自交系基因型间的培养能力具有较大的差异,7个玉米自交系幼胚都能诱导出初级愈伤组织。但是,形成胚性愈伤组织的能力上具有很大的差异,其中4个自交系178、R18红、综3、高油116可以形成胚性愈伤组织,178诱导率最高为78%。2.通过LS、N685、MB、MS四种诱导培养基的研究,确定了178幼胚最佳诱导愈伤组织培养基为LS+2,4-D 2.0 mg/L+L-pro 700 mg/L+CH 500 mg/L+3%蔗糖。通过研究,获得了玉米幼胚的最合适诱导、继代、分化和生根等一系列培养基和培养程序,建立了最高再生率为96%的以幼胚为外植体的高频再生体系。3.采用正交试验法和GUS染色方法,对幼胚农杆菌转化中的菌液OD值、侵染时间、AS浓度、共培养时间等4因素进行了优化,适宜的农杆菌介导的遗传转化参数为菌液OD600值为0.6、浸染时间为30 min、AS浓度为200μmol/L和共培养时间为2 d。通过将筛选培养分三轮进行,潮霉素浓度分别为3 mg/L、5 mgm、5 mg/L,优化了抗性愈伤筛选程序。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,转化率最高达到1.8%。初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。4.利用pCAMBIA 1301+Glu和pCAMBIA 1300+HMW+2F作为桥梁载体,成功地构建了表达型双片段干涉载体pCAMBIA 1301+Glu+2F,含有胚乳特异性启动子（麦谷蛋白Glu启动子）,sbeⅡb基因16、20外显子的双干涉片段和潮霉素抗性基因选择标记。利用冻融法将构建的干涉载体直接导入农杆菌EHA105中,该转化菌可用于下一步的玉米遗传转化。5.干涉表达载体pCAMBIA 1301+GIu+2F采用优化的农杆菌介导的玉米遗传转化体系转入玉米自交系178,并对移栽成活的5株玉米自交系178的再生植株进行PCR检测,初步证明sbeⅡb基因RNAi片段已整合到玉米基因组中。综上所述,本文通过对7个常规优良自交系再生能力和条件的研究,筛选并优化了178自交系幼胚的高频再生体系,优化并建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。成功构建了一个用于玉米直链淀粉品质改良的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化获得了5株PCR阳性苗。这些为深入开展玉米遗传转化和淀粉基因工程改良研究提供了重要的理论依据和方法。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 1.文献综述
• 2.引言
• 1.本课题研究意义
• 2.研究内容
• 3.技术路线
• 3.材料和方法
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 4.结果与分析
• 1.玉米优良自交系再生体系的优化
• 1.1 不同玉米自交系胚性愈伤组织的诱导
• 1.2 不同诱导培养基对诱导胚性愈伤组织的影响
• 1.3 幼胚状态对愈伤诱导的影响
• 1.4 继代对愈伤组织的影响
• 1.5 愈伤组织的分化与生根培养
• 1.6 壮苗培养以及移栽
• 2.玉米自交系农杆菌遗传转化研究
• 2.1 GUS染色结果评分
• 2.2 各因素对转化结果影响
• 2.3 菌液OD值对转化结果的影响
• 2.4 侵染时间对转化结果的影响
• 2.5 AS浓度对转化结果的影响
• 2.6 共培养时间对转化结果的影响
• 2.7 抗性愈伤组织的筛选培养与分化
• 2.8 转基因植株PCR检测结果
• 3. 双片段（1620）干涉载体的构建与转化
• 3.1 双片段（1620）干涉载体的构建与验证
• 3.2 干涉载体直接导入农杆菌的验证
• 3.3 干涉载体转化玉米及转化植株检测
• 5.结论
• 6.讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
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