转ipt基因及细胞工程草地早熟禾的抗逆性分析

论文摘要

草地早熟禾（Poa pratensis L.）属冷季型草坪草,是温带地区重要的草坪草种之一。它具有色美、耐荫、耐修剪、耐践踏等优点,能形成稠密的草皮,常用于草坪和绿地的建植中,但它也具有不耐炎热、抗旱力不强等缺点。由于草地早熟禾多采用兼性无融合方式繁殖,采用常规的育种方法培育新品种受到很大的限制。植物细胞工程和基因工程技术的发展为提高草地早熟禾品种的抗逆性提供了一条新途径。转ipt基因草地早熟禾的获得及耐冷性分析异戊烯基转移酶（isopentenyl transferase,IPT）是细胞分裂素合成途径的限速酶,过量表达ipt基因的转基因植株表现为细胞分裂素（CTK）含量增加,叶片衰老延迟。本工作以草地早熟禾无菌种子苗茎尖为材料,在附加适宜浓度6-BA和2,4-D的培养基上诱导丛生芽发生并继代培养,建立起了高效的丛生芽离体培养体系。然后以丛生芽芽尖为受体,利用根瘤农杆菌（菌株LBA4404,携带mini-Ti质粒pCAMBIA1300-ipt-bar）介导法将来源于根瘤农杆菌的ipt基因转入3个草地早熟禾优良品种中,经增殖后,移栽至花盆。对转化植株进行PCR和Southernblotting检测证实,ipt基因已转入草地早熟禾中。对转ipt基因的草地早熟禾和对照株系进行分蘖数比较,得出转正义ipt基因株系的分蘖数明显高于非转基因株系的,转反义株系的与对照植株差异不大。对离体叶片在不同条件下进行褪绿实验也发现,转正义基因株系的持绿性优于对照株系。将离体叶片在4℃下进行褪绿试验,发现转正义ipt基因植株叶片的持绿时间明显长于非转基因植株和转反义的植株的,而非转基因植株与转反义基因植株之间显差不明显。在济南自然过冬条件下,对转正义ipt基因株系和各自的未转基因对照品种进行耐冷性比较分析。植株形态观察表明,转正义基因植株具有明显提高的耐冷性,持绿期较长。生理指标测定表明,在10℃/1℃（昼/夜）温度下,转基因植株和对照植株的差异不显著;随着气温的降低,与对照植株相比,转基因植株出现冻害表型的时间晚,细胞膜受损伤程度低,叶绿素含量较高,即转基因植株比对照有更好的持绿性;在-8℃处理5天后,转基因植株也受害较轻,丙二醛含量和离子渗漏率较低。并且不同转基因株系的耐冷性存在明显差异,其中部分株系表现出比对照品种显著提高的耐冷性,具有很好的应用前景。草地早熟禾细胞工程植株的耐热性分析本实验室以继代培养的草地早熟禾丛生芽芽块为材料,经过49℃热胁迫处理和对存活株的选育,获得了一批耐热株系。本工作对这些通过细胞工程途径获得的耐热株系进行了耐热性分析。细胞工程植株和对照植株移栽到纸杯中,放于23℃下生长,选取生长状态一致的植株分别进行46℃5小时和40℃3天的热胁迫处理,并进行相关生理指标的测定。经46℃5小时的热胁迫处理后,各株系叶片的丙二醛含量和离子渗漏率都升高,但经过耐热筛选株系的升高幅度低于对照株;叶绿素荧光和叶绿素含量的测定结果也说明对照株光合系统受损较严重。即经过耐热筛选的株系具有提高的耐热性。对各项生理参数的测定还发现,各生理指标对热胁迫应答的速率及反应强度不同,叶绿素荧光对热胁迫最为敏感。经40℃3天热胁迫处理的株系,损伤程度大于46℃5小时热胁迫植株的损伤程度。叶绿素荧光和存活率的测定表明,细胞工程株系除N55株系外,其余均表现出较高的耐热性。本工作分别通过基因工程和细胞工程的方法对草地早熟禾优良品种进行了改良,为培育强抗冷性、持绿期长和耐热性好的新品种提供了优异材料,可促进草地早熟禾种植区域的扩大和提高草坪质量,有着广阔的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 前言
• 1.1 植物在逆境条件下的生理生化变化
• 1.2 细胞分裂素研究进展
• 1.2.1 细胞分裂素的概念和发现
• 1.2.2 细胞分裂素的生理作用
• 1.2.3 细胞分裂素的合成
• 1.3 异戊烯基转移酶（IPT）研究进展
• 1.3.1 异戊烯基转移酶与ipt基因的发现和研究
• 1.3.2 异戊烯基转移酶的种类
• 1.3.3 ipt基因遗传转化研究进展
• 1.4 植物体细胞无性系变异与育种
• 1.5 草地早熟禾基因工程研究进展
• 1.5.1 草地早熟禾的生物学特性
• 1.5.2 草地早熟禾遗传转化研究进展
• 1.6 草地早熟抗逆性研究进展
• 1.6.1 耐冷性研究
• 1.6.2 耐热性研究
• 1.6.3 其他逆境条件
• 1.7 本工作的目的和意义
• 1.7.1 获得耐冷性草地早熟禾种质的意义
• 1.7.2 获得耐热性草地早熟禾的目的和意义
• 第二部分 转IPT基因提高草地早熟禾耐冷性
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 农杆菌菌株和质粒
• 2.1.3 试剂、药品
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 转化受体的建立
• 2.2.2 转化植株的获得
• 2.2.3 转化植株的PCR检测和Sourthern-blot分析
• 2.2.4 植株分蘖能力统计
• 2.2.5 褪绿实验
• 2.2.6 转ipt基因植物的耐冷性分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 丛生芽继代培养基的改进
• 2.3.2 小芽的遗传转化和转化小苗的PCR及Southern-blot检测
• 2.3.3 分蘖数统计
• 2.3.5 褪绿实验
• 2.3.6 转基因植株耐冷性分析
• 第三部分 草地早熟禾细胞工程材料耐热性分析
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 草地早熟禾耐热材料的获得
• 3.2.2 细胞工程植株对热激处理的方式和生理指标测定的方法
• 3.2.3 细胞工程植株耐持续高温特性的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 草地早熟禾不同株系对热激处理的反应
• 3.3.2 草地早熟禾对长时间高温胁迫的反应
• 第四部分 讨论
• 4.1 细胞分裂素对草地早熟禾生长和抗逆性影响
• 4.2 IPT基因启动子与转基因植株的生长发育
• 4.3 利用细胞工程技术可有效获得耐热性提高的草地早熟禾新种质
• 4.4 转基因草坪草的意义
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表