己酮可可碱通过Raf途径抑制大鼠肝星状细胞增殖、促进凋亡

论文摘要

肝纤维化（hepatic fibrosis）是在肝脏慢性损伤与修复愈合的过程中形成的一种病理改变,细胞外间质（extracellular matrix,ECM）的过度合成与沉积是其主要特征。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）,也称贮脂细胞,并不是肝脏的主要细胞,仅占肝脏细胞的5%。在正常肝脏组织中,HSC处于静息状态;然而,在肝损伤时HSC可被激活发生明显的形态、结构和功能变化:分泌多种细胞因子、增殖和合成各种ECM的能力明显增强。因此,肝纤维化主要是由于HSC的激活导致ECM的大量增加,引起肝功能的损伤,并最终导致肝硬化。在HSC中各种信号转导通路共同参与肝纤维化的形成,因此,研究不同的信号转导途径,同时寻找新的信号转导通路对肝纤维化的形成机制进行系统研究,有助于对其发病机制更全面更深刻的理解。Raf-1蛋白激酶由648个氨基酸残基组成,分子质量为70～74kD,活化后具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性。Raf激酶的3个同工酶包括A-Raf、B-Raf与C-Raf（Raf-1）。Raf激酶主要功能是通过Ras/Raf/MEK/ERK通路,调节多种细胞功能,引起细胞的增殖和分化。此外,有研究表明Raf-1激活通过MEK/MERK通路介导抑制细胞凋亡。Raf-1激活有赖于酪氨酸蛋白激酶的活化。在Ras/Raf-1增殖信号途径中,Raf-1位于Ras的下游,其激活的初始事件是生长因子激活特异的受体酪氨酸激酶,活化的受体首先作用于Grb2-Sos蛋白复合物,Sos可使Ras活化,后者进一步激活Raf-1。Raf-1被激活后即继续激活其下游的MEK和MAPK,最终通过对转录调节因子表达的影响而将细胞增殖信号传递到细胞核内。表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）系一种常见的细胞因子,对上皮细胞、成纤维细胞及平滑肌细胞都有促进增殖的作用。己酮可可碱（pentoxifylline,PTX）为甲基黄嘌呤衍生物,是磷酸二酯酶抑制剂,目前主要用于外周血管病的治疗。体外研究显示PTX具有增加细胞内cAMP及改善血流动力学、免疫抑制和抗纤维化的作用。迄今,Ras/Raf/MEK/Erk信号传递通路为近年来信号传导方面研究最活跃的热点之一,很多研究表明该通路具有调控细胞增殖、分化等功能,但在肝纤维化发生中的作用研究较少。Raf是该信号通路中的重要一环。Raf-1能否被激活、是否能准确地下传信号对于细胞是否出现增殖效应至关重要。为此,我们应用体外细胞培养技术,探讨Ras/Raf信号通路阻断剂PTX对大鼠HSC中Raf磷酸化水平的抑制作用,从而为肝纤维化的发病机制和有效治疗提供理论依据。目的:探讨Ras/Raf信号通路阻断剂己酮可可碱对EGF刺激的大鼠HSC中Raf磷酸化水平的抑制作用,以及该信号通路对HSC增殖、凋亡的影响。方法:应用含8%胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素、4 mmol·L-1谷氨酰胺及1 mol·L-1 HEPES的DMEM培养液,37℃、5%CO2条件下体外培养HSC。利用EGF诱导激活HSC后,以一定浓度的PTX阻断Ras/Raf通路。采用Western blotting方法检测HSC中p-Raf的蛋白表达;采用流式细胞学的方法检测PTX对HSC凋亡的影响;采用MTT法等测定PTX对HSC的增殖抑制作用。结果:①PTX抑制HSC中Raf磷酸化水平。Western blotting方法分析示:EGF+PTX（40μg·mL-1）组p-Raf表达较EGF+PTX（20μg·mL-1）组间无明显差异（P>0.05）;EGF组p-Raf表达明显较对照组增高（P<0.01）;EGF+PTX（10μg·mL-1）组p-Raf表达较对照组减少了31.87%（P<0.01）。PTX干预浓度越高,蛋白表达下降趋势越明显,并呈剂量依赖性。用PTX干预EGF刺激的HSC,EGF+PTX（2h）组p-Raf表达较与对照组相比无明显差异（P>0.05）;PTX干预时间越长,p-Raf表达下降趋势越明显,呈时间依赖性。②PTX对HSC凋亡的影响:流式细胞学方法测定显示: PTX干预HSC 24h后,与空白对照组、EGF组、PTX（4h）组与PTX（8h）组相比,可明显促进细胞的凋亡。表明在EGF激活p-Raf后,抑制HSC凋亡,而PTX抑制p-Raf表达后,可有效的促进细胞凋亡。③PTX抑制HSC增殖。倒置显微镜下形态学观察,新传代的HSC呈圆形,富含折光脂滴。接种1 h部分细胞开始黏附,4.5 h伸展,24 h细胞突起明显伸长、增多。随培养时间延长,细胞渐呈典型星状形态,突起多而长,并呈簇状生长。应用PTX干预HSC 4h后,HSC的星状或梭状突起开始回缩,逐渐变为缩水状的圆形细胞,细胞间隙增大,由致密状变为网格状,12h开始有细胞脱落,24 h脱落细胞明显增多,悬浮于上清中,但细胞膜一直保持完整。MTT法:EGF刺激HSC后,与对照组相比,细胞生长明显,有统计学差异,P<0.01;EGF+PTX（4h）组、EGF+PTX（8h）组、EGF+PTX（24h）组与对照组相比细胞增殖明显受到抑制,均有显著的统计学差异,P<0.01。结论:Ras/Raf信号通路阻断剂PTX能够抑制EGF刺激的大鼠HSC中Raf-1的磷酸化水平,并呈时间和剂量依赖性。特异性阻断Ras/Raf信号通路能够抑制EGF刺激的HSC增殖、促进其凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 己酮可可碱通过Raf 途径抑制大鼠肝星状细胞增殖、促进凋亡
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 Raf-1 介导的信号转导通路及其与肝星状细胞的关系
• 致谢
• 个人简历