嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilium）热稳定性β-1，3-葡聚糖酶的纯化特性及cDNA克隆

论文摘要

β-1,3-葡聚糖酶属于水解β-葡聚糖的葡聚糖酶系,在自然界中存在广泛。β-1,3-葡聚糖酶参与生物的生长发育、新陈代谢等生理过程,是植物抗真菌病的重要物质之一。低分子量β-1,3-葡聚糖对异体宿主防御系统具有较强的诱导和活化作用,是一种免疫系统的活化剂。β-1,3-葡聚糖酶可应用于啤酒和葡萄酒酿造工程中酒的澄清、作为饲料添加剂、酵母原生质体制备、多糖的改性增溶、植物有害真菌防治与真菌细胞壁结构分析、医疗保健等方面。来源于嗜热真菌的各种酶,因为他们的热稳定性,引起了研究者们的高度关注。目前,虽然有部分研究报告报道了一些来源于真菌的β-1,3-葡聚糖酶,但是还未见有关嗜热真菌的热稳定性β-1,3-葡聚糖[酶的报道。嗜热毛壳菌（C. thermophilum）是一种广泛分布的嗜热真菌,是真核生物中生长上限温度很高的一种真菌。本研究分离纯化了嗜热毛壳菌的一种胞外β-1,3-葡聚糖酶,并研究了他的部分生理生化特性,并且对嗜热毛壳菌的β-1,3-葡聚糖酶cDNA进行了克隆。嗜热毛壳菌（C. thermophilum）在以麦麸为碳源的培养基中诱导产生的胞外β-1,3-葡聚糖酶粗酶液经80%饱和（NH4）2SO4沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析和凝胶层析等步骤获得了凝胶电泳蛋白带单一的β-1,3-葡聚糖酶。所得样品的比活力为45.4 U·mg-1,纯化倍数17.2倍,活力回收率为26.24。SDS-PAGE测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为76.3kDa。分离得嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度和pH分别为60℃和6.0。在pH6.0条件下,该酶在50℃以下稳定,60℃保温60min后,仍保留90%的酶活性,70℃的半衰期为20min。在酶与底物反应的条件下,加入不同的12种金属离子,使其终浓度为0.05mol/L,以不加金属离子的酶活为100%,测定其相对酶活。不同金属离子对酶活力的影响测定结果表明,Ca2+、Na+、对酶有激活作用;而一些重金属离子如Co2+、Zn2+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Cu2+、Ag+对酶有显著的抑制作用;K+、Mn2+、Ba2+对酶活的影响不大。利用液相色谱分析β-1,3-葡聚糖酶水解海带多糖产物表明分离纯化得到的β-1,3-葡聚糖酶是外切型β-1,3-葡聚糖酶。采用Edman降解法测定嗜热毛壳菌（C. thermophilum）β-1,3-葡聚糖酶N端8个氨基酸的序列为HWLGDIPH。与Genbank中其他真菌β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列同源性不高,氨基酸序列中只有WL和D与个别真菌β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列有一定的同源性。在麦麸诱导培养基上接种嗜热毛壳菌（C. thermophilum）,诱导产β-1,3-葡聚糖酶,接种4天后在培养基表面刮取菌丝,提取mRNA经反转录后获得cDNA。根据测得的纯化的C. thermophilum热稳定β-1,3-葡聚糖酶的N-端氨基酸序列和其他微生物β-1,3-葡聚糖酶同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法,克隆了该嗜热毛壳菌（C. thermophilum）的两个编码β-1,3-葡聚糖酶的cDNA片段glu-N和glu-I,Genbank的登陆号分别为EU744253和EU746500。β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I的cDNA序列为1267bp,包含一个1263bp的开放阅读框ORF,编码421个氨基酸的蛋白质,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N的cDNA序列为1273bp,包含一个1269bp的开放阅读框ORF,编码423个氨基酸的蛋白质。两段序列编码区推测出的氨基酸序列与真菌β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列同源性比较,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N编码氨基酸序列与Ampelomyces quisqualis, Coniothyrium minitansβ-1,3-葡聚糖酶氨基酸的同源性为52%,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I编码氨基酸序列与Aspergillus fumigatus, Hypocrea lixii, Cochliobolus carbonumβ-1,3-葡聚糖酶氨基酸的同源性为47%;且β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N和glu-I编码氨基酸序列包含β-1,3-葡聚糖酶的保守序列QQFT-RN、IQTETPY-QP,该区域可能与β-1,3-葡聚糖酶的催化活性相关。本研究克隆得到嗜热毛壳菌（C. thermophilum）的两个β-1,3-葡聚糖酶的新基因。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 文献综述
• 1.1 β-1,3-葡聚糖酶概述
• 1.2 β-1,3-葡聚糖酶的来源
• 1.3 β-1,3-葡聚糖酶的生理功能
• 1.4 β-1,3-葡聚糖酶的生物学以及分子生物学研究
• 1.4.1 植物β-1,3-葡聚糖酶
• 1.4.2 微生物β-1,3-葡聚糖酶
• 1.4.3 无脊椎动物β-1,3-葡聚糖酶
• 1.5 β-1,3-葡聚糖酶的应用
• 1.5.1 在饲料工业中的应用
• 1.5.2 在啤酒酿造业中的应用
• 1.5.3 食品添加剂
• 1.5.4 在医学中的应用
• 1.5.5 制备酵母β-1,3-葡聚糖
• 1.5.6 抗真菌
• 1.6 展望
• 2 选题的目的意义、研究内容、技术路线
• 2.1 选题的目的意义
• 2.2 研究内容
• 2.3 技术路线
• 第二章 嗜热毛壳菌热稳定性Β-1,3-葡聚糖酶的纯化及特性
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要仪器和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶酶活力测定
• 2.2.2 培养时间对嗜热毛壳菌产β-1,3-葡聚糖酶的影响
• 2.2.3 嗜热毛壳菌产β-1,3-葡聚糖酶的培养
• 2.2.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化
• 2.2.5 SDS-PAGE 对纯化得嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的纯度鉴定及测定其纯化分子量
• 2.2.6 高效液相色谱法测定嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶酶解产物
• 2.2.7 蛋白质含量测定
• 2.2.8 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶酶学特性的研究
• 2.2.9 纯化得嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶蛋白N-端氨基酸序列测定
• 3 结果与分析
• 3.1 不同培养时间对嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶活性的影响
• 3.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化
• 3.2.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶粗酶液Phenyl-Sepharose 疏水柱层析
• 3.2.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶粗酶液DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析
• 3.2.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶粗酶液Sephacryl S-100 凝胶柱层析
• 3.2.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶纯化过程总表
• 3.2.5 各层析处理后嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶蛋白纯度的鉴定
• 3.2.6 纯化得嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶蛋白分子量的鉴定
• 3.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的特性研究
• 3.3.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶最适反应温度
• 3.3.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶最适反应pH
• 3.3.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的热稳定性
• 3.3.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的pH 稳定性
• 3.3.5 不同金属离子对嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶活性的影响
• 3.3.6 高效液相色谱法测定嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的降解作用方式
• 3.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶酶蛋白N-端氨基酸序列测定
• 4 讨论
• 4.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的特性
• 4.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的纯化方法
• 4.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶降解作用的方式
• 4.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的稳定性
• 4.5 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶活性与金属离子的关系
• 4.6 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶活性与其疏水性的关系
• 4.7 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶的应用潜力和存在的问题
• 4.7.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶在生物防治方面的应用前景
• 4.7.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶工业化大规模生产、利用需解决的问题
• 第三章 嗜热毛壳菌热稳定性Β-1,3-葡聚糖酶基因的CDNA 克隆及其序列分析
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 酶和生化试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 溶液配制
• 2.1.7 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 产β-1,3-葡聚糖酶菌丝的诱导培养
• 2.2.2 总 RNA 的提取（Trizol 法）
• 2.2.3 紫外检测 RNA 产率和纯度
• 2.2.4 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.2.5 目的基因cDNA 的分离
• 2.2.6 序列的生物信息学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 嗜热毛壳菌总RNA 的提取
• 3.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶cDNA 的克隆
• 3.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I和glu-N的核苷酸序列及其编码氨基酸的序列
• 3.3.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I的核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列
• 3.3.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N的核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列
• 3.4 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I 和glu-N编码氨基酸序列的同源性比较
• 3.5 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I 编码氨基酸密码子偏爱性分析
• 3.6 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I 编码氨基酸的序列分析
• 3.6.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I 编码氨基酸的组成
• 3.6.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I 编码氨基酸的结构预测
• 3.7 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N 编码氨基酸密码子偏爱性分析
• 3.8 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N 编码的氨基酸序列分析
• 3.8.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N 编码氨基酸组成
• 3.8.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N 编码氨基酸的结构预测
• 4 讨论
• 4.1 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因及其编码氨基酸分析
• 4.2 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶cDNA 的克隆
• 4.3 嗜热毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因的研究
• 第四章 主要研究结论及后续研究建议
• 1 本研究获得的主要结论
• 2 对后续研究工作的建议
• 参考文献
• 致谢
• ACKNOWLEDGEMENT
• 攻读学位期间发表论文情况